2024呼吸道感染病原学诊断进展.docx

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1、2024呼吸道感染病原学诊断进展呼吸道感染病原学诊断是非常重要的基础，尤其对于一些重症、发展较快、初次经验性治疗效果不佳的患者，病原学诊断显得更加重要，它提供了第一手资讯，为我们更加有效的治疗提供了重要基础。我与大家交流的内容分为三个部分，第一部分，不同类型肺炎的病原谱；第二部分，呼吸道病原体传统诊断方法；第三部分，新型呼吸道病原体诊断技术。一、不同类型肺炎的病原谱在我国社区获得性肺炎（CAP）的病原谱分布中，病原体种类繁杂，人群分布差异大，成人和儿童略有区别，总体来看，成人最多见的是肺炎支原体、甲流、肺炎链球菌，这是新冠疫情流行前国内相关研究的结果，现在新冠乙类乙管后，可能会对病毒类呼吸道感

2、染引起的社区获得性肺炎的病原谱产生些影响。在儿童中，较多的是肺炎支原体、呼吸道合胞病毒和肺炎链球菌，与成人的病原谱略有区别，流感在儿童中也比较常见。这是我牵头做的中国重症社区获得性肺炎（SCAP）全国多中心的流调结果，在成人中得出的结论是最多见的病原为流感、链球菌、肠杆菌。有人问，肠杆菌科细菌为何在社区获得性肺炎中存在？因为我们讨论的是重症社区获得性肺炎，这些患者中肠杆菌还是很多见的。从这三大病原体的季节趋势来看，流感在冬季前后流行、常见于我国北方，夏季肠杆菌科细菌较流行，另外罕见病原体变得更常见，鹦鹉热衣原体、钩端螺旋体和支原体也可以引起重症，我们应该重视。支原体对于中国成人重症社区获得性肺

3、炎中，过去大家都遇到的诸多挑战，包括住院死亡率高（22.9%）、经济负担重（每位患者46000+人民币）、不同地区、区域的致病谱不同、病原体检出率低、需谨慎鉴别区分感染与定植或污染；还有可能即使送了病原学检查，阳性率也无法满足临床需求。因此，我们在一项研究中采用了多种方法平行送检，进行了病原体培养、血清学抗体、尿抗原检测、PCR检测、mNGS（DNARNA）,总阳性率得到了提高，达到72%。72%分子生物学方法常规显微观察和培养血清学和尿标本的免疫测定平行检验我们再看看中国医院获得性肺炎(HAP)病原谱，医院获得性肺炎最常见的病原体包括鲍曼、铜绿、肺克、金葡，机械通气相关性肺炎(VAP)是医院

4、获得性肺炎中由于使用气管插管、呼吸机导致的，或气管切开应用机械通气导致的肺炎。从病原微生物来看，VAP与HAP基本相似，而与社区获得性肺炎的病原体分布仍存在差别。UAC耐药菌检出率高BactonaJSPOCaMrM11rhoM-SMondaryhosprta)ieywk(i8Ja)i65ywf(45.47,4)Aneobcrar6umanrwsag&j7.A14018.0PMCXynonsMfuptnosa18.7-20.023-28.311.0KMOtSMAtopnurryuwBaI4.9317.1214)Stphyccoc9UfM941206-15.011.0h9cNacc3N311小8.

5、0FnfftocrCkMCM21T324NA4.34.0NAVAPBacterieltpecmi18yws(28.4-52)265yM(53.54AwMobacfrbaumarviu12.1YaS1O.1ft5PseudomonMMfVfynwia12.X7.527.7T4.6KMMAapfMUTXXMM9.Al6.16l1-13ASttpr)ononMm*cpMaU6.8.6二、呼吸道病原体传统诊断方法传统方法包括直接检测和间接检测两种。直接检测，顾名思义是直接找到病原体，包括培养方法（培养、鉴定、药敏试验）和非培养方法。培养方法主要针对细菌和真菌，但病毒及一些特殊病原体如支原体、衣原体的培

6、养比较困难，并且时间周期较长，无法满足临床诊断需求；非培养方法主要针对病原体的抗原检测，包括酶免疫法EIAx荧光免疫法IFA,在这个阶段中，尤其近几年的新冠疫情，检测抗原的方法也被广泛应用于筛查。间接检测是指病原体感染后，患者也就是宿主产生了对病原的反应，包括血清学改变、抗体产生，可通过检测抗体EIAxIFA,间接判断是否存在感染。酶免疫法EiA荧光免疫法IFA1、分离培养：传统方法中的培养使用得非常多，它是确诊的金标准，而且细菌和真菌还可以进行药敏试验，药敏数据为我们提供针对性药物治疗提供了重要参考，它的缺点是什么？培养周期较长，通常最快速度需要36-72小时才能出现培养结果，有些甚至需要几

7、天以上，无法完全满足临床需求；而且对培养的技术要求高，还会受到采样技术、转运条件等限制。StepsSamplingMicroscopyQUlCklDfOrOrqcultivationGrowth-basedASTpureculturesGramstainingMALDl/TOFManualorautomatedNAATdiskdiffusiontestorOutcomeBacterial number increasedIsolated coloniesPathogen identifiedMIC values determinedResult 36-72 hImmunodiagnostics

8、brothdilutiontestFISHIdentificationEnrichmentPlatingASTIPay2 pays3 pays2、抗原检测：目前新冠以及流感，我们使用较多的是直接或者间接方法来快速诊断是否存在病原体，即检测抗原是否存在，免疫荧光方法(DFAIFA)可作为早期快速诊断的初筛方法,但敏感性、特异性低，共同抗原会引起交叉反应，采样要求高，不规范采样易出现假阴性。酶联免疫吸附试验ELISA多为单一病原学检测，多项目检测需多产品并用，在一个检测板、试剂盒上常常只能检测单一病原体，费时又费力，且灵敏度、特异性低。3.抗体检测：适用于难培养的或特殊病原体的检验，如病毒、支原体

9、、衣原体、立克次体等，优点在于采样方便，速度快，缺点有两方面，第一，敏感性、特异度较低，因此无法用于常规诊断；第二，抗体的产生存在迟缓过程，即存在窗口期，易漏检，不适用于早期诊断，只能通过后续筛查，了解整个人群中感染过某个病原体的比例，或作为辅助诊断来参考。扇Apow4First stimulusSeCond sfimdusAnamnestic responseFIGURE 163 Relative humoral response to ant9en stimulation over time.Low level rmcim在呼吸道病原体传统诊断方法中，我牵头呼吸感染学组制定了肺部感染性疾病

10、支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识（2017年版），以便更好地制定SOP流程和技术标准。对支气管肺泡灌洗的采样方法，以及实验室如何处理、如何定量培养、镜检染色、标本质控，另外，离心后我们如何对沉淀物和上清液进行特殊检查？，例如显微镜下的直接镜检、特殊病原体培养、核酸检测以及真菌抗原检测都制定了详细流程。这个专家共识有很好的指导作用，发表后也受到了广泛的关注和好评。三、新型呼吸道病原体诊断技术这些技术相较于传统方法具有其优点和特点，如何利用这些优点和特点为呼吸道感染患者提供更快速、准确的诊断？我认为大家应该有更全面的了解。新型呼吸道病原体诊断技术分为两大类，一类是基于核酸扩增的技术,包括PCR

11、xRT-PCR,以及宏基因组包括二代测序等，另一大类是非基于核酸扩增，即不是检测病原体的DNA或者RNA核酸。基于核肉T增PCRr RT-PCRddPCRLAMPCRISPR/CasWGS, mNGS其他睁于核蹴增Lateral flow assayMALDI-TOF MS其他图：新型呼吸道病原体诊断技术一览以下几项是在呼吸道感染病原体检测中的新型技术。这些技术无论基于核酸还是非核酸，相较于传统方法，它们具有优势和特长，同时我们也需了解它们可能存在的缺陷，以便更好地选择。1、RT-PCR:基于核酸检测中使用最多的是RT-PCR尤其在过去的三四年中，我们在新冠检测中使用得很多,影响SARS-Co

12、V-2检测准确性的关键因素是什么？我们需要注意几个方面，首先是标本保存，有相应的特殊的病毒保存液以确保核酸不降解；第二，因为新冠病毒和流感病毒都是RNA病毒,核酸很容易降解,在运输过程中应该小于4摄氏度;第三，我们在准备期时需要做好相关工作，更好地防止降解RNA病毒的核酸；同时需要对检测试剂盒的质量做好把关；还有实验室条件，需达到P2标准实验室的标准才能进行病毒检测，特别是新冠病毒等检测；相关技术人员的培训和监督非常重要。2、基于ddPCR的核酸检测目前常见的数字PCR(digitalPCR,dPCR)主要有两类，分别为微腔室dPCR(CdPCR)和微滴式dPCR(ddPCR),以ddPCR为

13、例，其反应流程是通过将样品随机分散至成千上万个微反应单元(微滴)中，每个反应单元最多包含一个靶核酸分子，然后在每个微单元独立进行荧光PCR反应扩增反应结束后收集分析各个反应单元荧光信号，通过荧光信号的有无判断每个反应单元有无靶基因，最后利用泊松分布的原理来计算样品中的核酸拷贝数。这样看来，对于真菌、结核分枝杆菌等包壁较厚、破壁困难的病原体可以尝试使用ddPCR,RT-PCR检测的敏感性和特异性可能无法满足临床需求，以往，真菌检测的传统方法存在诸多不足，涂片镜检操作简单，但阴性结果不能排除感染可能；真菌培养耗时长、敏感性低，可能需要多次培养，甚至无法培养；G试验不能用于接合菌和隐球菌感染的检测，

14、无法鉴别致病菌种，具有较高的假阳性；GM试验诊断侵袭性曲霉病的敏感性为80.7%,特异性为89.2%,易受某些食物或药物的影响，假阳性率高达18%。对于真菌来说，使用微滴式dPCR可以大幅提高它的敏感性。我们研究团队正在准备开展侵袭性真菌菌属核酸检测试剂盒（数字PCR法）的临床试验，验证其检测有效性、准确性及可靠性。3、环介导等温扩增（LAMP）它有4个步骤，样本采集、样本准备（溶解、提取、纯化）、上机扩增及基于荧光或颜色改变的检测。优点主要体现在该方法利用4-6个引物识别目标序列的不同区域，在恒定温度（60-65。C）下通过茎环结构进行反复扩增，以达到检测靶基因的目的，相较于PCR技术，等温

15、扩增核酸检测简化了热循环反应过程，缩短了检测周期。我们研究团队开发了高度敏感和特异的LAMP检测方法用于肺炎克雷伯菌的临床鉴定和碳青霉烯类抗生素耐药性的检测：敏感性、特异性以及阳性和阴性预测值在痰样本上分别为100%、91%、90%和100%,这非常令人鼓舞。相关研究已发表在国际期刊上。LAMP用于诊断试剂临床转化过程中有一些需注意的要点，包括优化引物设计，以及完善标本的采集、运输和储存，改进核酸提取方法等，我们认为更重要的是如何将LAMP技术更好地形成诊断试剂盒，使其在临床微生物实验室中进行呼吸道感染病原体检测时更加小型化、便捷化和简洁化。Dn Principles Etti f genom kno*dg