第5章植物细胞制药三.ppt

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1、 20世纪90年代以来，对于植物细胞及其代谢产物的研究进入了新的发展时期，并出现了很多新技术和新方法，比如诱导子、前体饲养、两相培养法、质体转化、毛状根和冠瘿瘤组织培养等，显示了植物细胞培养工程制药的广阔发展前景。第七节 进展与展望一、诱导子在植物细胞工程研究中的应用 利用诱导子进行有目的的次生代谢产物调控及生物合成，成为大幅度提高培养物中代谢产物含量的重要方法之一。诱导子（elicitor），是植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应（hypersensitive reaction,HR,亦称抗性反应或自身防御反应）的因子，包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子。诱导子在植

2、物与微生物的相互作用中，能快速、高度专一性地诱导特定基因的表达。诱导子可作为研究植物次生代谢信号识别及其细胞内信息传递的良好实验体系。悬浮培养的西洋参细胞经刺盘孢菌丝状诱导子处理后，悬浮培养的西洋参细胞经刺盘孢菌丝状诱导子处理后，总皂甙产率由对照的总皂甙产率由对照的296mg/L296mg/L增长到了增长到了679mg/L679mg/L，并且，并且有有85%85%排放到了培养基中。排放到了培养基中。将果胶酶（将果胶酶（0.2%0.2%）添加到青蒿素合成培养基中，处理黄）添加到青蒿素合成培养基中，处理黄花蒿培养细胞花蒿培养细胞2 2天，青蒿素合成量比未加刺激的细胞提天，青蒿素合成量比未加刺激的细

3、胞提高了高了3.083.08倍。倍。真菌寡聚糖诱导子作为信号分子在南方红豆杉细胞悬浮真菌寡聚糖诱导子作为信号分子在南方红豆杉细胞悬浮培养体系中培养体系中 培养基中添加适量、适浓度培养基中添加适量、适浓度CuClCuCl2 2能够诱导紫杉醇的合能够诱导紫杉醇的合成，成，0.5-30vmol/L0.5-30vmol/L范围内，紫杉醇范围内，紫杉醇 含量随含量随CuClCuCl2 2浓度增加浓度增加而增加，而低于而增加，而低于0.5vmol/L0.5vmol/L时紫杉醇合成为零时紫杉醇合成为零1.诱导子的分类（1）定义 植物抗毒素是指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物，根据其功能又可

4、称为后感染防御物质。触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子，能够诱导植物细胞中的一个或几个反应，并能形成特征性自身防御反应的分子。诱导子可分为内源性诱导子和外源性诱导子（根据细胞内或外形成），或分为生物诱导子和非生物诱导子。生物诱导子是指植物在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质。所有不是植物细胞中天然成分但又能触发形植物抗毒素信号的因子称为非生物诱导子。（2）内源性诱导子 内源性诱导子主要指来自植物细胞的分子，多为植物细胞壁在微生物作用下的降解产物（如复杂多糖、糖蛋白）及沉积在细胞壁上的木质素。多糖类又分为纤维素、半纤维素及果胶类。（3）外源性诱导子外源性诱导子亦称真诱导子（genuine

5、 elicitor），是指病源微生物在入侵植物时自身被降解的产物及其代谢产物。目前应用最多的是真菌诱导子，根据其结构可分为4类。多糖类脱乙酰几丁质是真菌细胞壁被几丁质酶酶解是真菌细胞壁被几丁质酶酶解的产物，是广泛使用的多糖类诱导子，的产物，是广泛使用的多糖类诱导子，它可诱导植保素的产生。木质素类及蛋白酶抑制剂，如大如大雄疫霉（雄疫霉（Phytophthora megaspermaPhytophthora megasperma）是由大雄）是由大雄疫霉细胞壁分离得到的多糖类诱导子，也是最常疫霉细胞壁分离得到的多糖类诱导子，也是最常用的诱导子之一。用的诱导子之一。糖蛋白类作为微生物细胞壁组成成分之一

6、的糖蛋白类，可诱导引发防御反应。如在如在LuceneLucene悬浮培养细胞中悬浮培养细胞中加入来源于植物病原性真菌的加入来源于植物病原性真菌的和和-糖蛋白可产生糖蛋白可产生具抗菌作用的次生代谢产物。具抗菌作用的次生代谢产物。蛋白质类包括一些酶类及具蛋白性质的物质如绿色木霉如绿色木霉中的纤维素酶作为诱导子在中的纤维素酶作为诱导子在GrapnineGrapnine（真诱导子）（真诱导子）的悬浮培养中可引起的悬浮培养中可引起HRHR反应，另一来源于隐地疫霉反应，另一来源于隐地疫霉的具有蛋白质性质的诱导子亦能诱导的具有蛋白质性质的诱导子亦能诱导HRHR反应并大量反应并大量积累植保素积累植保素cryp

7、togeioncryptogeion。不饱和脂肪酸类不饱和脂肪酸类作为一种诱导抗性反应的诱导子，对其研究不是很充分，但已发现多聚不饱和脂但已发现多聚不饱和脂肪酸（花生四烯酸）及其部分酯类可诱导马铃薯植肪酸（花生四烯酸）及其部分酯类可诱导马铃薯植保素保素risnitinrisnitin和和lubiminlubimin的产生。的产生。2.诱导子的作用机制 诱导子在植物中的具体作用机制尚未形成一套详尽的理论体系。非生物诱导子（外部培养条件）协同诱导可增加特征酶群活性。生物诱导子除引起植物在其局部浸染部位做出迅速的过敏反应外，还诱导植物产生植保素，使植物得以免遭病原微生物的侵染和破坏。在此激活过程中，

8、诱导子与细胞膜上受体的结合，改变了膜离子通道，促使诱导过程迅速完成。不同的诱导子可通过植物表面的不同部位而起作用，也是激活反应中有关基因的表现。3.诱导子在组织和细胞培养及其次生代谢产物生合成研究中的应用 将诱导子应用于植物细胞培养中以提高目的产物产量，这些诱导子包括：（1）糖蛋白类诱导子：如在培养基中加入糖基如在培养基中加入糖基化的氧化牛血清白蛋白（化的氧化牛血清白蛋白（BSABSA）和氧化溶菌酶可使）和氧化溶菌酶可使烟草叶产生抗原性尼克碱次生代谢产物的产量增烟草叶产生抗原性尼克碱次生代谢产物的产量增加加1010倍。倍。（2）蛋白质类诱导子：使用果胶酶及链状蛋白使用果胶酶及链状蛋白酶作为诱导

9、子来调节烟草细胞培养中酪胺代途径酶作为诱导子来调节烟草细胞培养中酪胺代途径中某些的酶的活性。中某些的酶的活性。（3）多糖类诱导子：v用不同的诱导子，如镰刀霉菌丝体、乙烯、水杨酸、用不同的诱导子，如镰刀霉菌丝体、乙烯、水杨酸、几丁质和脱乙酰几丁质及其低聚糖，分别作用于多几丁质和脱乙酰几丁质及其低聚糖，分别作用于多种模型植物上，结果表明用植物病原体镰刀酶感染种模型植物上，结果表明用植物病原体镰刀酶感染植株可诱导产生几丁质酶及其同工酶，并表达了强植株可诱导产生几丁质酶及其同工酶，并表达了强效抗病原体的细胞溶解活性，说明植物可识别病原效抗病原体的细胞溶解活性，说明植物可识别病原体并可被诱导产生抗病原体

10、的几丁质酶。天然多糖体并可被诱导产生抗病原体的几丁质酶。天然多糖如几丁质、脱乙酰几丁质及其低聚糖也具有强效细如几丁质、脱乙酰几丁质及其低聚糖也具有强效细胞溶解活性的几丁质酶及其同工酶的各种功能。另胞溶解活性的几丁质酶及其同工酶的各种功能。另外，多糖类诱导子除诱导改善植物次生代谢产物的外，多糖类诱导子除诱导改善植物次生代谢产物的产量外，还可通过多糖的胶化性质改变植物细胞膜产量外，还可通过多糖的胶化性质改变植物细胞膜的通透性及流动性。的通透性及流动性。（4）微生物类诱导子：通常是真菌诱导子，方法是将通常是真菌诱导子，方法是将其悬浮培养的菌球匀浆处理，再将浆液高压灭菌处其悬浮培养的菌球匀浆处理，再将

11、浆液高压灭菌处理，弃去残渣，得提取物或无菌真菌菌丝体粗提物理，弃去残渣，得提取物或无菌真菌菌丝体粗提物.在无菌条件下将匀化产物加入到来源于不同组织、在无菌条件下将匀化产物加入到来源于不同组织、器官的细胞悬浮培养物中，同时作出作用时间曲线。器官的细胞悬浮培养物中，同时作出作用时间曲线。在紫杉属植物细胞培养物中为提高紫杉醇、紫杉在紫杉属植物细胞培养物中为提高紫杉醇、紫杉碱的产量而向培养基中添加的诱导子为灰黄霉素、碱的产量而向培养基中添加的诱导子为灰黄霉素、灰葡萄孢、大丽轮枝孢和融黏带酶的混合培养滤液，灰葡萄孢、大丽轮枝孢和融黏带酶的混合培养滤液，还有人用葡萄孢属的无菌菌丝体匀化产物诱导处理还有人用

12、葡萄孢属的无菌菌丝体匀化产物诱导处理罂粟细胞培养物来积累血根碱。罂粟细胞培养物来积累血根碱。不同诱导子作用于不同植物可以产生多种多样的次生代谢产物，可见从植物抗病生理角度来看，这些次生代谢产物多为植保素(植物抗病物质)，而在人类生活中，这些代谢产物也多为有益于人类健康的活性成分.另一方面，诱导子运用于植物组织培养中亦存在一些问题。如内源性诱导子及酵母提取物是无毒的，而来如内源性诱导子及酵母提取物是无毒的，而来源于真菌的诱导子多有很强的毒性源于真菌的诱导子多有很强的毒性.随着植保素的诱随着植保素的诱导合成，植物病原性真菌也诱导了一个过敏反应，就导合成，植物病原性真菌也诱导了一个过敏反应，就是病毒

13、与宿主细胞相互作用部位细胞的坏死，从而使是病毒与宿主细胞相互作用部位细胞的坏死，从而使细胞生长率下降，并可能影响次生代谢产物的产量。细胞生长率下降，并可能影响次生代谢产物的产量。降低诱导子浓度可以减少生长的停止状态，然而在诱降低诱导子浓度可以减少生长的停止状态，然而在诱导子作用下形成次生代谢产物的过程中，低浓度的诱导子作用下形成次生代谢产物的过程中，低浓度的诱导子只能引起部分诱导，所以诱导的剂量不同，引起导子只能引起部分诱导，所以诱导的剂量不同，引起的效应也不同。诱导子在不同的作用时间都将在一定的效应也不同。诱导子在不同的作用时间都将在一定程度上影响次生代谢产物的含量，如桔青霉诱导子对程度上影

14、响次生代谢产物的含量，如桔青霉诱导子对红豆杉培养细胞中紫杉醇生合成的影响实验显示，在红豆杉培养细胞中紫杉醇生合成的影响实验显示，在红豆杉细胞中指数生长期末期时加入诱导子，对紫杉红豆杉细胞中指数生长期末期时加入诱导子，对紫杉醇合成的促进作用最大。醇合成的促进作用最大。对于影响植物细胞培养物的生物量的增长和次生代谢产物的积累因素的变化，可因某一因素的调整而影响其他因素，所以在培养过程中要不断的加以平衡和研究。植物具有其本身的特殊性，因此对一种植物细胞或一种次生代谢产物适合的条件不一定适合于其它的次生代谢产物和细胞。诱导子在植物细胞培养物中对次生代谢产物的作用还有待于更进一步的系统研究。二、前体饲喂

15、 前体饲喂是增加次级代谢产物产率的重要方法。次级代谢产物的合成依赖于三种主要原材料的供应：莽草酸是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前体；氨基酸，形成生物碱及肽类抗生素；乙酸是聚乙炔类、前列腺素类、大环抗生素、多酚类、类异戊二烯等的前体。基本出发点是在细胞外创造一个次级代谢产物的贮存单元。在培养时可入固相或疏水液相，形成相培养系统，从而达到收集分泌物的目的。该法可以减轻产物本身对细胞代谢的抑制作用，并可保护产物免受培养基中催化酶或酸的影响。可简化下游处理过程，降低生产成本。三、两相法培养 四、转基本技术在次级代谢产物生产中的应用1.冠瘿组织和毛状根培养技术冠瘿组织是植物受发根农杆菌和根瘿农杆

16、菌感染后，农杆菌将质粒中的一段转移DNA片段整合到植物细胞核的DNA编码基因上，从而作为表现型在感染处长出的冠瘿瘤/毛状根。将冠瘿瘤/毛状根作为培养系统，可进行有用化合物的生产。五、植物生物转化技术与生物制药 利用植物细胞培养以及植物酶对外源底物进行生物转化，从而得到人们想要的目标化合物，称为植物生物转化技术。许多利用植物细胞和酶系统进行的生物转化具有部位以及立体特异性，其反应类型包括氧化反应、还原反应、羟化反应、甲基化反应、乙酰化反应、异构反应、糖基化反应以及酯化反应等。生物转化（biotransformation,bioconversion），也称生物催化（biocatalysis），是指利用生物离体培养细胞或器官及细胞器等对外源化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应，其本质是利用生物体系本身所产生的酶对外源化合物进行酶催化反应。具有反应选择性强（立体选择性、位置选择性）、反应条件温和、副产物少、不造成环境污染和后处理简单等优点，并且可以进行传统有机合成不能或很难进行的化学反应。1.概述作为生物催化剂，植物细胞培养具有下列优点：可以在实验室中生长，实验重现性好可以在实验室