分子诊断技术在结核病诊治中的应用.ppt

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1、分子诊断技术在结核病诊分子诊断技术在结核病诊治中的应用治中的应用全球结核病流行状况全球结核病流行状况WHO report，2013全球结核病流行状况全球结核病流行状况全球结核感染人数全球结核感染人数2004年后处于下降趋势年后处于下降趋势HIV患者并发结核病数量处于平稳阶段患者并发结核病数量处于平稳阶段中国结核感染人数全球排名第二中国结核感染人数全球排名第二WHO report，2013全球结核病流行状况全球结核病流行状况WHO report，2013全球结核病流行状况全球结核病流行状况全球结核死亡人数处于下降趋势全球结核死亡人数处于下降趋势斯威士兰结核病感染率最高斯威士兰结核病感染率最高WH

2、O report，2013全球结核病流行状况全球结核病流行状况Globally,an estimated 3.6%of new cases and 20.2%of previously treated cases have MDR-TBThere were an estimated 450,000 new cases of MDR-TB worldwide in 2012On average,an estimated 9.6%of MDR-TB cases have XDR-TBWHO report，2013全球结核病流行状况全球结核病流行状况 2012年全球新发结核病例为年全球新发结核病例为

3、860万人，万人，中国占总数的中国占总数的12%在在860万新病例中约万新病例中约110万人（万人（13%）为为HIV阳性，这些病例的阳性，这些病例的75%在非洲在非洲 每年约有每年约有130万人死于结核病，我国万人死于结核病，我国为为25万万 结核病每结核病每24秒钟就杀死秒钟就杀死1人人 预计未来预计未来20年还将有年还将有3600万人死于结万人死于结核病。核病。全球每年有全球每年有45万新发万新发MDR-TB，大约，大约4.3万为万为 XDR-TB流流 行行现现 状状感染人数多感染人数多死亡人数多死亡人数多耐药患者多耐药患者多潜伏感染多潜伏感染多“4多多”WHO report，2013结

4、核病诊治中存在的问题结核病诊治中存在的问题预防预防问题问题诊断诊断问题问题治疗治疗问题问题医疗医疗问题问题检验人员最关检验人员最关心的问题心的问题细菌载细菌载体疫苗体疫苗DNADNA疫苗疫苗灵敏度灵敏度特异性特异性标本类型标本类型 目的用途目的用途费用费用实验平台实验平台 检测时间检测时间方法选择方法选择方法选择的影响因素方法选择的影响因素孵育孵育4-8周周（阳性）（阳性）（阳性）（阳性）涂阳涂阳=60-98%有结核分枝杆菌，有结核分枝杆菌，因此涂阳后最好用分子生物学因此涂阳后最好用分子生物学方法进行快速鉴定方法进行快速鉴定IGRAs、TST等等RNA水平水平DNA水平水平蛋白质水平蛋白质水平

5、恒温扩增恒温扩增 变温扩增变温扩增 鉴定鉴定 鉴定鉴定+耐药耐药结核病分子结核病分子诊断诊断 扩增扩增 杂交杂交LAMP、SDA 芯片、芯片、RT-PCRSAT、TMAFISH、Probe分子诊断适宜技术的选择分子诊断适宜技术的选择T-SPOT.TB与与 QFT-GI为为IGRAs实验实验潜伏性结核潜伏性结核（LTBILTBI）结核菌素试验（结核菌素试验（TST）T-SPOT.TBQuantiFERON-TB Gold in-tube(QFT-GI)蛋白质水平蛋白质水平全血全血IFN-释放分析技术释放分析技术(IGRA)结核感染者体内存在特异的效应结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应淋

6、巴细胞，效应T淋巴细淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。）。因此，检测效应因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。的诊断。由于效应由于效应T细胞细胞存活时间很短存活时间很短，而且，而且具有特异性具有特异性，因此可，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于基于IGRA原理的产品目前已被原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本国、意大利、瑞士

7、、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中本国的结核诊疗指南中-干扰素释放实验干扰素释放实验酶联免疫斑点技术酶联免疫斑点技术培养滤液蛋白培养滤液蛋白10（CFP 10）早期抗原靶早期抗原靶6（ESAT-6）一、一、T-SPOT技术基础技术基础由结核杆菌基因组由结核杆菌基因组RD1区相区相同的操纵子编码的蛋白同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（所有的卡介苗（BCG）均丢）均丢失该基因序列失该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌也绝大多数的环境分枝杆菌也不存在不存在RD1区区结核杆菌特异抗原结核杆菌特异抗原ESAT-6与与CFP 10抗原抗原PlamaPBMCsGel Ba

8、rrierErythrocytes检测过程检测过程分离分离PBMCs加入加入PBMCs与结核特异抗原与结核特异抗原37孵育孵育16-20小时小时PBMCs特异抗原特异抗原-干扰素抗体干扰素抗体加入标记二抗，孵育加入标记二抗，孵育1小时小时加入显色液，终止反应加入显色液，终止反应观察结果：观察结果：1个斑点个斑点=1个效应个效应T细胞细胞结果判断图结果判断图阴性结果阴性结果阳性结果阳性结果空白对照空白对照抗原抗原 AESAT-6抗原抗原 BCFP10阳性对照阳性对照（PHA）潜伏性结核（潜伏性结核（LTBI）诊断技术比较）诊断技术比较IGRAs与与TST相比，具有更相比，具有更高的灵敏度和特异性

9、高的灵敏度和特异性IGRAs与与BCG,NTM无交叉无交叉反应，反应，TST有交叉反应有交叉反应难以从感染者中鉴别出活难以从感染者中鉴别出活动性肺结核患者动性肺结核患者小于小于5岁儿童、免疫力低下岁儿童、免疫力低下患者不适合采用患者不适合采用IGRAs检测检测试剂成本非常高试剂成本非常高 costs（费用）（费用）availability for clinicians and other health workers（医疗水平）（医疗水平）patient acceptability（患者是否接受）（患者是否接受）ease of distribution and storage（实验平台）（实验

10、平台）核酸扩增技术核酸扩增技术核酸扩增技术反应条件扩增产物检测方法代表公司RT-PCR热循环热循环DNA实时实时RocheRT-LAMP恒温恒温DNAEikenGenoType MTBDRplus热循环热循环DNAHain LifescienceCPA恒温恒温DNA优思达优思达NASBA恒温恒温 RNAbioMerieuxTMA恒温恒温RNA终点终点Gen-ProbeSAT恒温恒温RNA实时实时仁度仁度SAT：Simultaneous Amplification and Testing(RNA仁度仁度)CPA:Cross Priming Amplification(DNA/RNA,优思达优思达

11、)LAMP:Loop-Mediated Isothermal Amplification(DNA,Japan)TMA:Transcription Mediated Amplification(RNA,Gen-Probe)GenoType MTBDRplus：(Hain Lifescience)NASBA:Nucleic Acid Sequence-Based Amplification(RNA,OT)RCA:Rolling Circle Amplification(DNA,Molecular Staging)HDA：Helicase-Dependant Amplification(DNA,Bi

12、ohelix,NEB)RNA 拷贝数拷贝数 DNA拷贝数拷贝数 生命力旺盛的病原体生命力旺盛的病原体RNA转录活跃转录活跃较好的愈后指标较好的愈后指标交叉污染少交叉污染少RNA作为临床分子诊断靶标作为临床分子诊断靶标二、二、SAT技术技术 同一温度下（同一温度下（42），以），以RNA为起始模板为起始模板，通过，通过M-MLV反转录酶产生一反转录酶产生一个双链个双链DNA拷贝拷贝，然后利用，然后利用T7 RNA多聚酶多聚酶从从DNA拷贝上产生多个（拷贝上产生多个（1001000个）个）RNA拷贝；每一个拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环

13、；同时，带有荧光标记的同时，带有荧光标记的探针探针和这些和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况RNA(+)Forward PrimerRTRNase H activityReverse PrimerRTT7100-1000 copiesMolecular BeaconReverse PrimerForward PrimerRT/RNase H activityRNA(+)DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(+)RNA(-)RNA(-)RNA(

14、-)DNA(+)DNA(+)TB-SAT操作步骤操作步骤阳性结果阳性结果阴性结果阴性结果恒温扩增恒温扩增-42CRNA 检测检测-起始靶标与扩增产物都是起始靶标与扩增产物都是RNA扩增产物的污染更少扩增产物的污染更少-RNA环境中易降解环境中易降解更高的扩增效率更高的扩增效率-30分钟内扩增分钟内扩增10亿倍亿倍反应稳定反应稳定-抑制物少抑制物少高灵敏度、特异性高灵敏度、特异性活菌检测活菌检测操作简单、快速操作简单、快速MTBDRsl-鉴定鉴定XDRMTBDRplus-鉴定鉴定MDRMTBC-鉴定鉴定MTB复合群复合群MTBCM-鉴定鉴定MTB和和NTMGene-Probe(TMA/Hain)

15、技术技术三、三、MTBC-鉴定鉴定MTB复合群复合群(TMA技术技术)方法名称：方法名称：HPV（Hybridization Protection Assay）-杂交保护分析法为杂交保护分析法为Gen-probe公司专利公司专利原理：原理：以以rRNA为靶标，采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群为靶标，采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群检测设备：检测设备：LEADER 50iHPA-MTD(Mycobacterium Tuberculosis Direct):2.5h 报告，直接从标本中检测结核菌报告，直接从标本中检测结核菌HPA-Accuprobe:1h 报告，用菌落或自动培养系统的菌

16、报告，用菌落或自动培养系统的菌样本样本细胞溶解细胞溶解目标目标 r-RNA释放释放MTD技术路线技术路线杂交体杂交体rRNAAEAEAEAEAEAEAEAE60C15分钟分钟加入探针加入探针探针探针杂交杂交AEAEAE选择性试剂选择性试剂60C化学发光读数仪化学发光读数仪 荧光检测荧光检测MTD技术特点技术特点MTD结核分枝杆菌检测技术特点结核分枝杆菌检测技术特点n采用分子技术快速鉴定（2.5小时小时）结核分枝杆菌复合群n标本可以是涂片阴性或者阳性涂片阴性或者阳性的痰标本；也可以是培养物n唯一获得FDA推荐推荐的凃阴样本快速检测技术n检测RNA，RNA只能来源于活的细菌，可鉴定活动性结核病人）n采用TMA恒温扩增恒温扩增，不使用PCR仪器，无需专业的PCR实验室认证nHPA杂交保护分析技术：灵敏、特异灵敏、特异n严格的实验室防污染技术实验室防污染技术：整个实验过程所有试剂和样本全部在同一个反应管内进行，杜绝交叉污染MTD结核分枝杆菌的直接检测意义结核分枝杆菌的直接检测意义nTB与其他分枝杆菌区分与其他分枝杆菌区分 AIDS患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染 龟分枝杆菌