李兆华猪精液冷冻保存技术.ppt

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1、内 容猪精液冷冻保存的意义猪精液冷冻保存的意义猪精液冷冻技术研究概况猪精液冷冻技术研究概况猪精液冷冻技术操作流程猪精液冷冻技术操作流程影响猪精液冷冻效果的因素影响猪精液冷冻效果的因素如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力1 1、延长公猪使用年限；、延长公猪使用年限；2 2、获得更大的遗传进展；、获得更大的遗传进展；2 2、取代活体公猪的引进；、取代活体公猪的引进；3 3、生物安全的保证。、生物安全的保证。猪精液冷冻保存的意义 从意大利人从意大利人SpallanzaniSpallanzani最早开始研究哺乳动物精液最早开始研究哺乳动物精液冷冻开始至己有冷冻开始至己有20

2、0200多年的历史多年的历史 。猪的精液冷冻研究是从猪的精液冷冻研究是从19491949年英国人年英国人PolgePolge等发现甘等发现甘油油(丙三醇丙三醇)对牛精子具有抗冻保护作用后开始的。对牛精子具有抗冻保护作用后开始的。19561956年，他首次报道了应这个原理进行猪精液的冷冻操作，年，他首次报道了应这个原理进行猪精液的冷冻操作，并进行人工授精。并进行人工授精。19571957年年HessHess等将猪冻精经子宫颈输入，并产下仔猪。等将猪冻精经子宫颈输入，并产下仔猪。19751975年，年，PurselPursel等发明了简便的猪精液冷冻和解冻等发明了简便的猪精液冷冻和解冻方法，从此打

3、开猪冷冻精液的商品化之路。方法，从此打开猪冷冻精液的商品化之路。（用颗粒状冷冻精液给（用颗粒状冷冻精液给2323头青年母猪输精头青年母猪输精,48h,48h后剖检后剖检1111头头,有有5 5头受孕头受孕;25-30d;25-30d后剖检另外后剖检另外1212头头,有有1010头怀孕）头怀孕）猪精液冷冻技术研究概况猪精液冷冻技术研究概况我国从我国从7070年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索。年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索。19751975年西安市草滩农场试配了年西安市草滩农场试配了8 8头母猪头母猪 。19771977年成立了全国猪冻精协作组。年成立了全国猪冻精协作组。19861986

4、年冷冻精液累计配种母猪年冷冻精液累计配种母猪6 6万余头，万余头，近几年：近几年：甘肃农业大学甘肃农业大学 张兆旺教授张兆旺教授南京农业大学南京农业大学 芮荣教授芮荣教授西北农林科技大学西北农林科技大学 李青旺教授李青旺教授四川农业大学四川农业大学 马恒东教授马恒东教授东北农业大学东北农业大学 刘娣教授刘娣教授上海农科院上海农科院 张德福研究员张德福研究员猪精液冷冻技术操作流程精液采集精液采集质量检测质量检测第一次稀释第一次稀释降温、平衡降温、平衡（1515，5 5）第二次稀释第二次稀释平衡平衡冷冻冷冻保存保存猪精液冷冻技术操作流程颗粒法冻精的冷冻程序颗粒法冻精的冷冻程序1)1)新鲜精液在常温

5、、等温条件下，用不含甘油的新鲜精液在常温、等温条件下，用不含甘油的I I液稀释，然后平衡液稀释，然后平衡0.50.52h;2h;2)2)缓慢降温至缓慢降温至1515维持维持4h4h，再从，再从1515经经1h1h降至降至5;5;3)3)用等温的含甘油的用等温的含甘油的IIII液进行稀释。液进行稀释。4)4)稀释后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒。稀释后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒。利用广口液氮罐，以聚四氟乙烯板作为冷冻面，冷冻面与液氮面距离为利用广口液氮罐，以聚四氟乙烯板作为冷冻面，冷冻面与液氮面距离为1 12cm2cm，待，待冷冻面充分预冷后，用预冷的滴冻管在氟板上连续等量滴冻。其始冻温度为冷冻面充分预

6、冷后，用预冷的滴冻管在氟板上连续等量滴冻。其始冻温度为-110-110-125125，滴冻时间控制在，滴冻时间控制在60s60s内完成，加盖熏蒸平衡内完成，加盖熏蒸平衡3 34 4 分钟后，浸入液氮中保存。分钟后，浸入液氮中保存。细管法和塑料袋法的冷冻程序细管法和塑料袋法的冷冻程序1)1)新鲜精液在室温下，用稀释液将精液按比例等温稀释，然后平衡新鲜精液在室温下，用稀释液将精液按比例等温稀释，然后平衡0.50.52h2h。2)2)将精液移入将精液移入1515条件下降温平衡条件下降温平衡3h3h。3)3)在在1515条件下离心条件下离心(800g(800g，10min),10min),加入无甘油的

7、加入无甘油的I I液，缓慢降到液，缓慢降到55，平衡，平衡2h2h，加入含甘油的，加入含甘油的IIII液，然后分装。液，然后分装。4)4)程序冷冻仪冷冻：程序冷冻仪冷冻：初始温度为初始温度为55，以，以33minmin从从55降到降到-5-5，再于，再于-5-5条件下保持条件下保持1min1min结晶，然后结晶，然后以以5050minmin从从-5-5降到降到-140-140，然后投入液氮保存。，然后投入液氮保存。5)5)液氮熏蒸冷冻：液氮熏蒸冷冻：在广口液氮罐内，与液氮面距离在广口液氮罐内，与液氮面距离5cm5cm处，熏蒸处，熏蒸2020分钟，然后投入液氮保存。分钟，然后投入液氮保存。影响猪

8、精液冷冻效果的因素个体的影响个体的影响 个体对精液冻后效果影响极大。应用限制性片断长度多态个体对精液冻后效果影响极大。应用限制性片断长度多态(AFLP)(AFLP)分析控分析控制精子冷冻能力的基因，没有发现差异。差异的机制仍需要继续研究制精子冷冻能力的基因，没有发现差异。差异的机制仍需要继续研究冻前处理的影响冻前处理的影响 冷休克：可能原因是质膜中特别的组成成分所致。冷休克：可能原因是质膜中特别的组成成分所致。猪精子膜磷脂酰胆碱的含量较牛低，而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量高猪精子膜磷脂酰胆碱的含量较牛低，而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量高 胆固醇胆固醇/磷脂的比例低，且胆固醇的分布不对称，外膜的分布

9、量大于内膜磷脂的比例低，且胆固醇的分布不对称，外膜的分布量大于内膜 离心：离心：800g800g，10min10min影响猪精液冷冻效果的因素冷冻保存承载工具的影响冷冻保存承载工具的影响 承载工具：颗粒、承载工具：颗粒、0.25mL0.25mL、0.5mL0.5mL小型细管和扁平细管；小型细管和扁平细管；5mL 5mL 的大型细管的大型细管 5mL5mL塑料袋。塑料袋。如如FP(Flat-PackFP(Flat-Pack，300mm300mm22mm22mm0.2mm)0.2mm)和和MFP(a multiple Flat-Pack)MFP(a multiple Flat-Pack)。冷冻解冻

10、程序的影响冷冻解冻程序的影响 冷冻速率：冷冻速率：303050/min50/min。解冻速率：。解冻速率：120012001800/min1800/min 冷冻冷冻 0.25mL0.25mL微型细管：微型细管：50/min50/min、1.51.5甘油浓度；甘油浓度；0.5mL0.5mL小型细管：小型细管：30/min30/min、3 3甘油浓度；甘油浓度；5mL5mL大型细管：大型细管：16/min 16/min、3.33.3甘油浓度。甘油浓度。解冻解冻 0.25mL0.25mL、0.5mL0.5mL细管：细管：5050，12s12s或或3737，20s20s；5mL5mL细管：细管：505

11、0，40s40s 5mL 5mL塑料袋：塑料袋：5050，13s13s影响猪精液冷冻效果的因素稀释液的组成稀释液的组成 大体上，包括糖，蛋白质，脂类，缓冲剂，冷冻保护剂和一些添加物质。大体上，包括糖，蛋白质，脂类，缓冲剂，冷冻保护剂和一些添加物质。渗透压的影响渗透压的影响 最佳渗透压：最佳渗透压：420420580mOsm/Kg580mOsm/Kg为最佳渗透压为最佳渗透压糖的影响糖的影响 双糖（半乳糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖等）双糖（半乳糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖等）顶体完整率；顶体完整率；单糖（尤其是果糖和木糖）单糖（尤其是果糖和木糖）精子冻后活率。精子冻后活率。配合使用效果比单一使

12、用好配合使用效果比单一使用好影响猪精液冷冻效果的因素冷冻保护剂的影响冷冻保护剂的影响 常用：甘油、二甲基亚砜常用：甘油、二甲基亚砜(DMSO)(DMSO)、丙二醇、丙二醇(PROH)(PROH)、乙二醇、乙二醇(EG)(EG)、木糖醇、木糖醇、乙酰胺、阿东糖醇等。乙酰胺、阿东糖醇等。作用过程：作用过程：（1 1）冲淡溶液中溶质盐浓度，细胞摄入盐量减少，由抗冻剂代替；）冲淡溶液中溶质盐浓度，细胞摄入盐量减少，由抗冻剂代替；（2 2）抗冻剂进入细胞，改变了胞内过冷状态，使胞内压接近胞外压，降）抗冻剂进入细胞，改变了胞内过冷状态，使胞内压接近胞外压，降低了细胞脱水皱缩程度和速度；低了细胞脱水皱缩程度

13、和速度；（3 3）抗冻剂进入细胞，缓解了精子在解冻时的渗透性肿胀引起的损伤。）抗冻剂进入细胞，缓解了精子在解冻时的渗透性肿胀引起的损伤。效果：甘油保护效果最好，但有毒。效果：甘油保护效果最好，但有毒。方向：联合使用，最终除去甘油方向：联合使用，最终除去甘油影响猪精液冷冻效果的因素添加物的影响添加物的影响 缓冲：磷酸二氢钾、柠檬酸钠、缓冲：磷酸二氢钾、柠檬酸钠、TrisTris等；等；抗菌：青霉素、链霉素等；抗菌：青霉素、链霉素等；洗涤剂：洗涤剂：OEPOEP（氨基（氨基-钠十二烷基硫酸酯）、钠十二烷基硫酸酯）、SDSSDS（十二烷基硫酸钠）等；（十二烷基硫酸钠）等；抗氧化：维生素抗氧化：维生素

14、E E、GSHGSH（谷胱甘肽）等（谷胱甘肽）等 激素类：激素类：PGFPGF2a2a 其他：透明质酸、其他：透明质酸、N-N-乙酰基乙酰基-D-D-氨基葡糖等氨基葡糖等 影响猪精液冷冻效果的因素抗氧化剂在猪精液冷冻保存上的应用研究抗氧化剂在猪精液冷冻保存上的应用研究 抗氧剂种类抗氧剂种类效果效果维生素维生素E E 200mol200mol水溶性水溶性VEVE提高解冻后精子的活力和线粒体的活性；提高解冻后精子的活力和线粒体的活性；200-200-1000mol-VE1000mol-VE能提高解冻后精子的活力，能提高解冻后精子的活力，200mol200mol能保护精子脂质能保护精子脂质的氧化的氧

15、化 谷胱甘肽（谷胱甘肽（GSH GSH）获能状精子减少，体外受精率提高获能状精子减少，体外受精率提高 二丁基羟基甲苯二丁基羟基甲苯 （BHTBHT）添加添加0.20.2、0.40.4、0.8mmolBHT0.8mmolBHT，解冻后精子存活率提高，脂质氧化降低，解冻后精子存活率提高，脂质氧化降低，体外受精的胚胎发育率得到提高（体外受精的胚胎发育率得到提高（1616：2929，囊胚发育率），囊胚发育率）过氧化氢酶（过氧化氢酶（Catalase Catalase）单独或与单独或与SODSOD联合使用能提高解冻后精子存活率。与丙酮酸，巯基乙醇联合使用能提高解冻后精子存活率。与丙酮酸，巯基乙醇一起添加，显著提高解冻后精子的活力，但是对精子的形态和存活时一起添加，显著提高解冻后精子的活力，但是对精子的形态和存活时间无影响。间无影响。超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SOD SOD）单独或与过氧化氢酶联合使用，提高解冻后精子存活率。单独或与过氧化氢酶联合使用，提高解冻后精子存活率。如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力选择优良的个体选择优良的个体稀释液中要添加抗氧化的物质稀释液中要添加抗氧化的物质 BHT,GSH,SOD,BHT,GSH,SOD,过氧化氢酶，过氧化氢酶，VEVE等。等。输精时间要尽可能和排卵时间吻合输精时间要尽可能和排卵时间吻合提高输精精子剂量提高输精精子剂量