食品酶学第7章.ppt

《食品酶学第7章.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《食品酶学第7章.ppt（60页珍藏版）》请在优知文库上搜索。

1、第七章第七章固定化酶和固定化活细胞固定化酶和固定化活细胞 酶工程简介 酶工程主要研究范围酶工程主要研究范围酶的生产、纯化、固定化技术、酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造、酶分子结构的修饰和改造、在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用 根据研究和解决问题的手段不同根据研究和解决问题的手段不同 化学酶工程化学酶工程(初级酶工程初级酶工程)酶工程酶工程 生物酶工程生物酶工程(高级酶工程高级酶工程)天然酶天然酶化学修饰酶化学修饰酶固定化酶固定化酶人工模拟酶人工模拟酶克隆酶克隆酶突变酶突变酶新新 酶酶固定化酶固定化酶 固定化酶固定化酶(immob

2、ilizedenzyme):(immobilizedenzyme):通常酶催化通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。酶的固定化方法大致分为酶的固定化方法大致分为物理法物理法和和化学法化学法，物理法有物理法有吸附法吸附法和和包埋法包埋法；化学法有；化学法有共价偶共价偶联法联法和和交联法交联法 。固定化酶固定化酶固定化的酶的优点固定化的酶的优点 固定化的酶具有高的催化效率和高度专一性固定化的酶具有高的催化

3、效率和高度专一性 固定化酶提高了对酸碱和温度的稳定性，增固定化酶提高了对酸碱和温度的稳定性，增加了酶的使用寿命加了酶的使用寿命 可简化工艺，反应后易与反应产物分离，减可简化工艺，反应后易与反应产物分离，减少了产物分离纯化的困难，而提高了产量和少了产物分离纯化的困难，而提高了产量和质量质量 目前，固定化酶已经在工农业、医药、分析、目前，固定化酶已经在工农业、医药、分析、亲和层析、能源开发、环保和理论研究等方亲和层析、能源开发、环保和理论研究等方面得到了广泛应用，取得了丰硕成果。面得到了广泛应用，取得了丰硕成果。第一节第一节 酶固定化技术发展史酶固定化技术发展史第二节第二节 固定化酶的制备方法固定

4、化酶的制备方法第三节第三节 固定化酶的特性固定化酶的特性第四节第四节 固定化酶的催化反应机理探讨固定化酶的催化反应机理探讨第五节第五节 固定化活细胞固定化活细胞第六节第六节 酶催化反应器及其类型酶催化反应器及其类型 第一节第一节 酶固定化技术发展史酶固定化技术发展史 固定化酶是固定化酶是2020世纪世纪6060年代发展起来的一种新年代发展起来的一种新技术。技术。早在早在19161916年年NelsonNelson和和GriffinGriffin首先发现酶不溶首先发现酶不溶于水而具有酶活性这一现象。于水而具有酶活性这一现象。19481948年年SummerSummer把刀豆脲酶制成非水溶性酶，把

5、刀豆脲酶制成非水溶性酶，也同样具有酶活力。也同样具有酶活力。1953年由年由Grubhofer和和Schleith等采用聚氨苯乙烯树脂等采用聚氨苯乙烯树脂重氮化法实现了羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶和核糖核重氮化法实现了羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等酶的固定化。酸酶等酶的固定化。1960年日本田边应用化学研究所著名学者千烟一郎将年日本田边应用化学研究所著名学者千烟一郎将固定化酶应用到工业上，开始了氨基酰化酶的固定化固定化酶应用到工业上，开始了氨基酰化酶的固定化研究，研究，1969年夏天，他成功地将固定化氨基酰化酶反年夏天，他成功地将固定化氨基酰化酶反应用于应用于DL氨基酸的光学拆分上，实现了

6、酶连续化氨基酸的光学拆分上，实现了酶连续化反应的工业化，在世界上开创了固定化酶应用于工业反应的工业化，在世界上开创了固定化酶应用于工业生产的先例。生产的先例。20世纪世纪60年代后期，固定化酶的研究相继在年代后期，固定化酶的研究相继在美国和欧洲等国展开美国和欧洲等国展开 1971年，第一届酶工程会议正式建议采用固年，第一届酶工程会议正式建议采用固定化酶的名称。定化酶的名称。我国固定化酶的研究起步较晚，开始于我国固定化酶的研究起步较晚，开始于1970年，先在年，先在染料工业使用双功能试剂将染料工业使用双功能试剂将硫酸酯乙砜基苯胺引硫酸酯乙砜基苯胺引入固定化领域，用于多糖载体与多种酶共价结合，后入

7、固定化领域，用于多糖载体与多种酶共价结合，后来还研制成功固定化来还研制成功固定化5，一磷酸二酯酶生产单核苷酸，一磷酸二酯酶生产单核苷酸，固定化青霉素酰化酶生产固定化青霉素酰化酶生产6氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6APA)和固定化葡萄糖异构酶生产果葡糖浆等，成功应用于和固定化葡萄糖异构酶生产果葡糖浆等，成功应用于工业化生产。工业化生产。第二节第二节 固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法一、吸附法一、吸附法二、包埋法二、包埋法三、共价键结合法三、共价键结合法四、交联法四、交联法在制备固定化酶时，必须保在制备固定化酶时，必须保证酶活力部位的氨基酸残基证酶活力部位的氨基酸残基不发生变化，避免那些导致不发

8、生变化，避免那些导致酶蛋白高级结构破坏的操作酶蛋白高级结构破坏的操作一、吸附法一、吸附法1.1.物理吸附法物理吸附法 酶被载体吸附而固定化的方法酶被载体吸附而固定化的方法 常用的载体有活性炭、多孔玻璃、多孔陶瓷、酸性常用的载体有活性炭、多孔玻璃、多孔陶瓷、酸性白土、漂白土、高岭土化铝、硅胶、膨润土、羟基白土、漂白土、高岭土化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；有机有淀粉、谷磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；有机有淀粉、谷蛋白、丁基或己基蛋白、丁基或己基葡聚糖凝胶、纤维素及其衍生葡聚糖凝胶、纤维素及其衍生物壳素及其衍生物等。物壳素及其衍生物等。物理吸附法物理吸附法具有酶活力部位及其空

9、间构象不具有酶活力部位及其空间构象不易坏的优点，但酶附着在载体上，存在易于易坏的优点，但酶附着在载体上，存在易于脱落等缺点。脱落等缺点。曾采用固定化的酶有曾采用固定化的酶有淀粉酶、糖化酶、葡淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等。萄糖氧化酶等。2.离子吸附法离子吸附法 离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体静电作用力相结合的固定化方法。不溶性载体静电作用力相结合的固定化方法。离子吸附法的载体有多糖类离子交换剂和合离子吸附法的载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂。例如成高分子离子交换树脂。例如DEAE纤维素、纤维素、ECTEOLA-纤维素、纤维素

10、、TEAE纤维素、纤维素、CM纤维素、纤维素纤维素、纤维素柠檬酸盐、柠檬酸盐、DEAE-葡聚糖葡聚糖凝胶、凝胶、Amberlite CG50、IRC50、IR-45、IR-120、IRXE97、Dowex50等。等。离子吸附法操作简单，处理条件温和，酶活离子吸附法操作简单，处理条件温和，酶活力部位的氨基酸残基不易被破坏。但是，载力部位的氨基酸残基不易被破坏。但是，载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。应时，酶往往会从载体上脱落。采用此法固定的酶有葡萄糖

11、异构酶、糖化酶，采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶，淀粉酶、纤维素酶等。淀粉酶、纤维素酶等。包埋法可分为包埋法可分为网格型网格型和和微囊型微囊型两种。两种。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的空间构象，酶活行结合反应，很少改变酶的空间构象，酶活回收率较高，因此，可以应用于许多酶的固回收率较高，因此，可以应用于许多酶的固定化，但是，在发生化学反应时，酶容易失定化，但是，在发生化学反应时，酶容易失活，必须巧妙设计反应条件。活，必须巧妙设计反应条件。二、包埋法二、包埋法 包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶，包埋法只适合作用于小分

12、子底物和产物的酶，对于那些作用于大分子底物和产物的酶是不对于那些作用于大分子底物和产物的酶是不适合的，因为只有小分子可以通过高分子凝适合的，因为只有小分子可以通过高分子凝胶的网格扩散，并且这种扩散阻力还会导致胶的网格扩散，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变，降低酶活力。固定化酶动力学行为的改变，降低酶活力。1.1.网格型网格型 网格型网格型 将酶包埋于高分子凝胶细微网格内将酶包埋于高分子凝胶细微网格内 采用网格型包埋法的固定化载体有聚丙烯酰胺、采用网格型包埋法的固定化载体有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等高分子化合物，以及淀聚乙烯醇和光敏树脂等高分子化合物，以及淀粉、明胶、卡拉胶

13、、胶原、大豆蛋白、壳聚糖、粉、明胶、卡拉胶、胶原、大豆蛋白、壳聚糖、海藻酸钠和角叉菜胶等天然高分子化合物。海藻酸钠和角叉菜胶等天然高分子化合物。2.2.微囊型微囊型 微囊型微囊型 将酶包埋在高分子半透膜中制备成微囊型将酶包埋在高分子半透膜中制备成微囊型 界面沉淀法、界面聚合法、二级乳化法、界面沉淀法、界面聚合法、二级乳化法、液膜液膜(脂质体脂质体)法法 (1)界面沉淀法界面沉淀法 该法是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解该法是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋的。度极低而形成皮膜将酶包埋的。此法条件温和，酶不易失活，但要完全除去膜上残留此法条件温和，酶不易失

14、活，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很困难。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维的有机溶剂很困难。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。此法曾用于固定化天门冬酰胺酶、脲酶等。此法曾用于固定化天门冬酰胺酶、脲酶等。(2)界面聚合法界面聚合法 是将亲水性单体和疏水性单体利用界面聚合的原理使是将亲水性单体和疏水性单体利用界面聚合的原理使酶包埋于半渗透性聚合体中的方法。酶包埋于半渗透性聚合体中的方法。该法制备的微囊的大小能随乳化剂浓度和乳化时的搅该法制备的微囊的大小能随乳化剂浓度和乳化时的搅拌速度而自由控制，制备过程所需时间非常短。但在拌速度而自由控制，

15、制备过程所需时间非常短。但在包埋过程中由于发生化学反应而会引起某些酶失活。包埋过程中由于发生化学反应而会引起某些酶失活。此法曾用聚脲制备过天冬酰胺酶、脲酶等的微囊。此法曾用聚脲制备过天冬酰胺酶、脲酶等的微囊。(3)二级乳化法二级乳化法 将一种聚合物溶于一种沸点低于水，且与之将一种聚合物溶于一种沸点低于水，且与之不混合的溶剂中，加入酶的水溶液，并用油不混合的溶剂中，加入酶的水溶液，并用油溶性表面活性剂为乳化剂，制成第一个乳化溶性表面活性剂为乳化剂，制成第一个乳化液。液。常用的高聚物有乙基纤维素、聚苯乙烯、氯常用的高聚物有乙基纤维素、聚苯乙烯、氯橡皮等，常用的有机溶剂为苯、环己烷和氯橡皮等，常用的

16、有机溶剂为苯、环己烷和氯仿。仿。二级乳化法法制备比较容易，酶几乎不失活，二级乳化法法制备比较容易，酶几乎不失活，但残留的有机溶剂难以完全去除，而且膜也但残留的有机溶剂难以完全去除，而且膜也比较厚，会影响底物扩散。比较厚，会影响底物扩散。二级乳化法法曾用乙基纤维素和聚苯乙烯制二级乳化法法曾用乙基纤维素和聚苯乙烯制备成过氧化氢酶、脂肪酶等微囊。备成过氧化氢酶、脂肪酶等微囊。(4)液膜液膜(脂质体脂质体)法法 液膜液膜(脂质体脂质体)法是近年来研制成功的一种新型法是近年来研制成功的一种新型微囊法，基本原理是利用表面活性剂和卵磷微囊法，基本原理是利用表面活性剂和卵磷脂等形成液膜而将酶包埋。脂等形成液膜而将酶包埋。其显著特征是底物或产物的膜透过性不依赖其显著特征是底物或产物的膜透过性不依赖于膜孔径的大小，而只依赖于对膜成分的溶于膜孔径的大小，而只依赖于对膜成分的溶解度，因此可以加快底物透过膜的速度。解度，因此可以加快底物透过膜的速度。此法曾用于糖化酶的固定化。此法曾用于糖化酶的固定化。共价键结合法是将酶与水不溶性载体以共价键结合共价键结合法是将酶与水不溶性载体以共价键结合 与载体共价结合的酶功能