A型流感病毒对小鼠肺部菌群及趋化因子CCL5和CXCL10的影响及麻杏石甘汤干预作用研究.docx

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1、目的探索麻杏石甘汤（MaXingShiganDeCOCtion,MSD）通过影响小鼠肺部菌群及趋化因子CCL5和CXCLlO表达而防治流感病毒感染的潜在机制。方法通过鼻腔接种法建立A型流感病毒感染小鼠模型，经ig给药或生理盐水3、7d后，计算肺指数和肺指数抑制率，HE染色检测肺组织病理变化，应用免疫组化、酶联免疫吸附试验（ELISA）、实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测肺组织中CCL5和CXCLlO蛋白和mRNA表达变化，并取小鼠肺组织进行16SrRNA基因V3V4可变区测序、物种注释及聚类，分析AIPha多样性和Beta多样性及组间差异物种，分析CCL5、CXCLIO表达与肺部菌群变化

2、的关系。结果给药3d后，模型组肺指数明显高于对照组（PV0.01）和药物组（PV0.05、0.01）,肺部炎性细胞浸润明显。麻杏石甘汤组肺部炎性细胞浸润明显减轻，肺指数抑制率与奥司他韦组相似，肺损伤的组织学定量评价指标（IQA）值较模型组明显降低（P0.05,组间丰富度和多样性无差异。Beta多样性分析结果显示，给药3d后，组间样品点无交集，组间肺菌群构成有差异。各组间有显著性差异物种。Spearman相关性分析显示，CCL5和CXCLlO表达与埃希菌属、变形杆菌属、拟杆菌属丰度呈正相关，与粪球菌属丰度呈负相关。给药7d后，各组间肺部菌群结构组成及CCL5、CXCLlO表达无显著差异。结论麻杏

3、石甘汤可能通过促进肺部有益菌生长改善肺部微生态环境及免疫微环境，对流感病毒引起的肺损伤有一定的保护作用。流行性感冒（简称流感）是由流感病毒（influenzaviruses）引起的急性呼吸道传染病。根据其核蛋白和基质蛋白不同，流感病毒分为甲（八）、乙（B）、丙（C）、T（D）4型，其中A型流感病毒GnfluenzaAvirus,IAV）是引起人和动物感染的主要病原体1。尽管流感常有自限性，但部分患者会发展成急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征，出现呼吸衰竭和多器官损伤，并最终死亡2。目前，病毒感染所致的“细胞因子风暴”与肺损伤的相关性被普遍认同3。所谓“细胞因子风暴”是指机体免疫系统过度激活引起趋化

4、因子（CC、CXC.C及CX3C家族）和促炎细胞因子（TNF-a、IL-I、IL-6、IL-12、IFN-a、IFN-IFN-y、MCP-I和IL-8等）过度释放，初衷是为了清除病毒，但这种自杀式的攻击，也可能诱导全身性炎症反应，引起多器官功能衰竭，甚至死亡4。研究发现，流感病毒可诱导人和动物体内CCL5（CCCehemokineligand5）和CXCLlO（C-X-CmotifChemokine-10）等趋化因子的产生，CCL5和CXCLlO在甲型流感病毒感染诱导的小鼠急性肺损伤中发挥重要作用5-6。近年来，随着新一代测序技术的应用，肺部微生物群在呼吸系统疾病发生发展中的作用受到关注。谷李

5、铭等网研究发现，流感病毒感染可致肺部微生物群结构和物种多样性发生变化；LlOyd等9研究发现肺部菌群结构与局部炎症反应发生相关；阚亮等10研究发现，肺炎链球菌感染可促进趋化因子CXCLl和CCL5表达，募集免疫细胞至感染部位，促进肺部炎症发生发展。因此，对肺部微生物群的调控可能成为治疗流感病毒性肺炎的新靶点。源自汉代张仲景伤寒论的麻杏石甘汤（MaXingShiganDeCoCtion,MSD）具有辛凉宣肺、清热平喘之功效，主治肺热火盛的肺炎和热邪犯肺的哮喘，广泛用于流感、病毒性肺炎、上呼吸道感染、支气管肺炎等的治疗II。2019年12月以来，新型冠状病毒SARS-CoV-2（severeacu

6、terespiratorysyndromecoronavirus2）感染肺炎（coronavirusdisease2019,CoVlD-19）疫情在全球爆发，10个月时间，感染人数已超过3千万，波及全球200多个国家和地区12。在国家卫生管理部门发布的系列新型冠状病寿的肺炎诊疗方案及各地方结合区域和人群特点发布的本地区新型冠状病毒的肺炎防治方案中，具有宣肺平喘、祛除寒湿、通腑泻热兼燥湿健脾之效的MSD及其加减方是COVlD-19临床治疗期（中期）被推荐使用频次最高的中药方剂之一13。本课题组前期研究发现，该方具有干预病毒吸附、抑制病毒增殖、抑制宿主细胞凋亡等作用14-16。本研究以流感病毒感染

7、BALB/c小鼠为模型,观察MSD对不同感染时期（急性期和恢复期）小鼠肺部菌群及趋化因子CCL5和CXCLlO表达的影响，以期进一步阐明其防治流感的可能机制,为拓展其临床应用提供新的实验依据。1材料1.1 动物68周BALB/c小鼠50只，体质量（182）g,雄性，购于实验动物有限公司许可证号O,动物批号；于中医药大学实验动物中心许可证号饲养。所有实验符合中医药大学动物实验伦理学规定。1.2 病毒株流感病毒小鼠肺适应株（A型，IAV,A/PR/8/34）,由师范大学病毒研究室惠赠。10日龄鸡胚尿囊腔接种培养传代，血凝效价1:640以上者用于实验。正式试验前根据文献方法17,测定小鼠病毒半数致死

8、量（LD50）,病毒LD50为1X10-3.77,用灭菌生理盐水稀释成每0.1亳升病毒液含50LD50,置于冰袋中备用。1.3 药物与试剂MSD（麻黄9g,杏仁9g,石膏18g,甘草6g）组方药材麻黄（批号）、杏仁（批号）、石膏（碎，棉裹，批号）、甘草（批号），购自中医药大学附属第一医院门诊药房，由中医药大学第一附属医院药学部教授鉴定均为中国药典2015年版收录正品，麻黄为麻黄科植物木贼麻黄EphedraequisetinaBge.的干燥草质茎；杏仁为蔷薇科落叶乔本植物山杏PrunusarmeniacaL.var.ansamaxim的干燥成熟种子；石膏为硫酸盐类矿物硬石膏族石膏，主要化学成分为

9、含水硫酸钙（CaSO42H2O）；甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFiSCh.的干燥根及根茎。磷酸奥司他韦胶囊规格：75mg（以奥司他韦计）X10粒，批号，意大利RocheS.p.A.生产上海罗氏制药有限公司分装购自门诊药房，用蒸播水充分溶解，制成实验用质量浓度为2.165mg/mL的混悬液；抗病毒颗粒（规格：9gX10袋，批号，制药有限公司）购自中医药大学附属第一医院门诊药房，用蒸储水充分溶解,制成实验用质量浓度为039g/mL的溶液。以上实验用药4避光保存备用。兔抗小鼠RANTES抗体（AbCam公司，批号）、CXeLlO多克隆抗体（AbCam公司，批号）、驴抗兔

10、IgG荧光二抗（AbCam公司，批号）、通用二步法试剂盒（生物技术有限公司，批号PV-9000）、小鼠CXCLIO/IP-IoELISA试剂盒（生物科技有限公司，批号）、CCL5/RantesELISA试剂盒（生物科技有限公司，批号）、TRIZOn总RNA提取试剂盒（生物科技有限公司，批号）、HiFiSCriPtCDNA合成试剂盒（生物科技有限公司，批号）、UhraSYBRMiXtUre（生物科技有限公司，批号）、PCR引物由生物工程有限公司合成。1.4 主要仪器BSC-1300IIA2生物安全柜、SW-CJ-IFD超净工作台，空气技术有限公司；TP-200D电子分析天平，天平仪器设备有限公司

11、；RMZI35精密轮转切片机，德国LElCA公司；光学扫描显微镜（AXioSCoPe5）Axiocam503color显微镜摄像头，蔡司科技（）有限公司；TGL20M高速冷冻离心机，离心机仪器有限公司；IlluminaMiseq测序仪，美国Illumina公司；ELX-800多功能酶标仪，美国BiO-Tek公司；LighlCyCIer96荧光定量PCR仪，瑞士罗氏公司。2方法2.1 MSD水煎液的制备参照文献方法18-19,采用麻黄先煎方法制备MSD水煎液。按其组成比例分别称量5剂药的药材量。先取麻黄45g,加入药材总量10倍体积的蒸储水，武火煎煮，待沸腾后，调整为文火煎煮25min,去沫，再

12、加入石膏90g、杏仁45g、甘草30g,继续文火煎煮30min,煎煮完毕后滤过；二煎加入7倍体积蒸馅水武火煮沸后再文火煎煮20min,煎煮完毕后滤过，合并2次滤液，水浴浓缩至含生药0.605gmL,40C避光保存备用。2.2 分组与给药实验设对照组、模型组、奥司他韦组（化学药对照组）、抗病毒颗粒组（中药对照组）和MSD组，每组10只小鼠。按临床等效剂量（临床等效剂量按动物每千克体质量占人体表面积的比值计算21）于感染后24h开始ig给药，每天1次，每次0.2mL,连续给药3、7do奥司他韦、抗病毒颗粒、MSD组的给药剂量分别为以奥司他韦计21.63mg（kgd）3.9g（kg-d）,6.05g

13、（kgd）o对照组和模型组均给予ig等量生理盐水。2.3 制备模型实验动物适应性饲养3d后称定质量。除对照组动物外，其余动物按照本课题前期研究方法建立A型流感病毒肺部感染模型20。用乙酸轻度麻醉小鼠后，每只小鼠鼻孔内均匀滴入50LD50流感病毒液0.05mL,建立模型。对照组动物隔离饲养在同等条件下的房间，并按同样方法鼻腔接种0.9%氯化钠溶液0.05mLo2.4 标本采集分别于给药治疗第3、7天，禁水禁食8h后，每组随机选取5只小鼠，称动物体质量后，摘眼球放血法处死小鼠，转移至超净工作台内解剖，称取小鼠肺脏质量，收集部分肺组织置于4%多聚甲醛中固定，用无菌镜子将部分肺组织取下，置于EP管中，

14、冻存于-80冰箱。2.5 检测指标2.5.1 肺指数和肺指数抑制率称小鼠体质量后，取肺脏称定质量，计算肺指数和肺指数抑制率。肺指数=肺脏质量/体质量肺指数抑制率=（模型对照组平均肺指数一给药组平均肺指数）/模型对照组平均肺指数2.5.2 肺组织病理变化苏木素-伊红（HE）染色检测肺组织病理变化。用4%的多聚甲醛固定肺组织、石蜡包埋、切片（45gm）、HE染色后，在光学显微镜下（X400）观察组织病理变化。对肺组织进行病理学评分，每组选6张切片，每张选4个视野（义400）,计数损伤肺泡肺泡内含有红细胞（RBC）或白细胞（WBC）2个占计数肺泡总数百分比，作为肺损伤的组织学定量评价指标（index

15、ofquantitativeassessment,IQA）253免疫组织化学检测肺组织CCL5、CXCLIO表达PV-9000通用二步法检测各组小鼠肺组织中CCL5、CXCLlO蛋白表达水平。石蜡切片常规脱蜡，水化，抗原修更，内源性过氧化物酶阻断,室温孵育1015min,PBS溶液冲洗,滴加适量CCL5、CXCLIO一抗37孵育60min,阴性对照组用PBS缓冲液代替一抗；PBS溶液冲洗3次后滴加反应增强剂，室温孵育20min；滴加辣根酶标山羊抗兔IgG聚合物，室温孵育20min；加DAB显色剂处理5min,自来水冲洗，苏木素复染20s,1%盐酸分化，自来水冲洗返蓝；脱水、透明、封片，镜下观察结果。细胞膜和细胞质棕褐色或者棕黄色着色为阳性细胞，以细胞不着色为阴性。用Axiocam503COk）I采集图像，选取结构完整的1张切片，在高倍镜下（X400）,每张切片任选5个视野，应用Image-ProPlus5.0图像分析软件计算每个视野阳性表达的吸光度（八）值，然后求其均值，作为该