呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程.docx

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1、呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程RegulationsofgermpIasmresourcesCryopreservationonHuIunBuirsheep点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施内蒙古自治区市场监督管理局-./-刖百本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由中国科学院东北地理与农业生态研究所提出。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：中国科学院东北地理与农业生态研究所、内蒙古自治区农牧业科学院、中国科学院西北高原生物研究所、赤

2、峰学院本文件主要起草人：房义、薛树媛、杨其恩、李九月、莫显红、贾功雪、冯春涛、钟荣珍、郭晓飞、毕江华。呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程1范围本文件规定了呼伦贝尔羊种质资源保存的冷冻解冻液制备、低温平衡、冷冻、贮存和解冻等等。本文件适用于呼伦贝尔羊的冷冻精液、冷冻卵母细胞、冷冻胚胎的生产。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语适用于本文件。3.1种羊breedingram具有优秀品质、外形、生产和繁育性能等种用价值的呼伦贝尔羊羊，体质健康，无遗传病。3.2精液semen指雄性动物在射精时，从尿道中射排出体外的液体。3.3卵母2田胞oocyte在卵子发生过程中进行两次减数

3、分裂的卵原细胞。3.4胚胎embryo是指雄性生殖细胞和雌性生殖细胞结合成为合子之后，经过多次细胞分裂和细胞分化后形成的有发育成生物成体的能力的维体。冷冻保存cryopreservation经冷冻保护剂的溶液处理，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下实现长期保存的过程。4精液冷冻保存4.1冷冻方法在大规模精液冷冻情况下，采用程序冷冻仪；在精液量较少，冷冻条件比较落后的养殖场，采用液氮熏蒸冷冻法。4.1 准备工作1 .1.1冷冻稀释液配制配方1：I液：乳糖(102.96gL)s庆大霉素(IOmgZml)x卵黄(20%)、PH(6.8)11液：庆大霉素(IOmg/ml)、半脱脂奶粉(40

4、gL)、甘油(10%)、PH(6.8)配方2：I液：柠檬酸(14gL)xTris(27gL)、果糖(IOML)、PH(7.0)U液：柠檬酸(MgZL)、Tris(27gL)、果糖(Iog/L)、甘油(10%)、海藻糖(Q2M)、PH(7.0)4 .1.2标记用于稀释、离心、低温平衡、冷冻用的不同规格细管、试管、器皿等提前做好标记(羊号等)。4. 2精液选择精子活力270%、密度21.5义1。9个/矶的精液用于后续冷冻。5. 3精液处理6. 3.1离心用离心液(PBS)5倍比例稀释原精液，缓慢搅拌，放置5min,以60OrPm离心10min,移除上清液。7. 3.2稀释向各离心管中加入等温稀释液

5、，根据其活力、密度稀释，轻轻混匀，并将所有离心后的精液收集到一个大的离心管内。8. 4低温平衡采用等温I液稀释精子浓度为IO个mL,在冰箱冷藏（4C）平衡2h；然后，采用Il液稀释精子终浓度为1XK）8个mL,在冰箱冷藏（4）（分两步：计算好总共需要多好体积H液，首先采用一半体积II液稀释，平衡20分钟，再采用另一半体积U液稀释，平衡1小时40分钟）。9. 5装管采用冻精细管罐装封口一体机将精液分装到025mL或0.5InL细管中，细管提前标好生产场、品种、种公羊号和生产日期等精液信息。如果精液数量较少，也可采用口吸发把待冻精液吸入管内，另一端迅速用封口粉密封。10. 6冷冻11. 6.1程序

6、化冷冻利用程序冷冻仪，在4一35C的温区，设置6/分钟的降温速率，在-35CTO（TC的温区，设置20/分钟的降温速率。12. 6.2熏蒸冷冻将液氮倒入深度50Cm以上的专用冷冻箱预冷IOnIin,保持冷冻支架高于液氮面4cm,将分装好的细管精液铺放在冷冻支架上，熏蒸冷冻7min。13. 贮存细管冻精以25只包装单位装入特制塑料管内，塑料管再以50只包装单位装入自制的纱布袋，迅速投入液氮罐。纱布袋提前做好标记，标明生产场、品种、种公羊号、生产日期和支数等。4. 8解冻盛放冻精细管的提漏不得提出液氮罐口，用预冷的长镜子夹取1支冻精，时间不得超过6秒；直接在液氮罐夹取冻精细管存在困难的情况下，也可

7、选择体积合适的泡沫盒，装入三分之二体积的液氮，把纱布袋迅速取出置于泡沫盒内，抽取所需精液细管。冻精细管放置于40C水浴锅中缓慢搅动IOS取出，无菌纱布擦拭干净，备用。5卵母细胞冷冻保存5.1冷冻方法OPS冷冻方法（玻璃化冷冻）。5.2卵母细胞选择在体视显微镜下挑选至少有3层卵丘颗粒细胞包裹，胞质均匀的卵丘卵母细胞复合体(cumulusOOCjles-COmplcxeCOCs)进行玻璃化冷冻。5. 2.1成熟卵母细胞将体外成熟24h的COCst在含Ql%(wv)透明质酸酶中消化，去除卵母细胞周围全部卵丘颗粒细胞，挑选胞质均匀、折光性好的裸卵进行玻璃化冷冻保存。5.3试剂与溶液5.3.1基础液mP

8、BS液：DPBS(Gibco)100mL1添加Qoo36g丙酮酸钠、Qlg葡糖糖、0,3gBSAoFS液：300g/L聚蔗糖(ficoU70000,Sigma)添力口05molL蔗糖(sucrose),经mPBS溶解后配制而成。5. 3.2玻璃化冷冻液(VS)VSl:基础液为mPBS,含7.5%(vv)乙二醇(ethyleneglycolEG)+7.5%(vv)二甲基亚碉(dimethylsulfoxidDMSO)+20%(vv)胎牛血清(FBS)oVS2：基础液为FS,含15%(vv)EG+15%(v)DMSO+20%(vv)FBSo5.33解冻液(TS)TSl：基础液为mPBS,含1InO

9、IZL蔗糖。TS2:基础液为mPBS,含0.5mol/L蔗糖。TS3:基础液为mPBS,含0.25mol/L蔗糖。mPBS(含5%(vv)FBS),为解冻后卵母细胞的培养液。5. 4冷冻5. 4.1OPS制备将0.25mL塑料细管(France)加热变软后拉成OPS,规格为管壁内径为Q2mm,管壁厚Q02mm。在空气中冷却后用手术刀片在其细端切开，细端长度2cm左右。5. 4.2卵母细胞平衡玻璃化冷冻液及使用器材在室温(25)至少平衡30min,在培养皿中制作100200L的VSl和VS2液滴，并用记号笔进行标记。保温杯中倒入90%体积的液氮，15mL离心管壁扎眼儿(贴标签，记录羊只信息、卵母

10、细胞质量和数量、日期等)，放入保温杯中，用于OPS的收集。6. 4.3卵母细胞冷冻将卵母细胞(5枚为宜)在VSl液中平衡30s,再移入VS2液中渗透25s,将卵母细胞及少量VS2玻璃化冷冻液吸入OPS中，并立即投入离心管(含液氮)中，盖好盖子，转移到液氮罐中保存。7. 5解冻8. 5.1平衡使用器材在室温(250C)至少平衡30min。在一个培养皿中加入2mL的TSI液，在另一个培养皿中分别制作200HLTS1、TS2、TS3解冻液微滴，置于37电热恒温台上，至少加热IOnIintJ保温杯中倒入90%体积的液氮，并将OPS从液氮罐中转移至保温杯。9. 5.2解冻将OPS从液氮中取出，迅速插入盛

11、有TSl的培养皿中，排出卵母细胞并计时。将卵母细胞移入新鲜的TSl液中平衡InIin,卵母细胞在TSl液中换位至少5次。将卵母细胞移入新鲜的TS2液中，平衡5min。再将卵母细胞移入新鲜的TS3液中，平衡5min。最终将卵母细胞在培养液中洗涤，置于二氧化碳培养箱中恢复0.62h,备用。6胚胎冷冻保存9.1 胚胎选择根据国际胚胎移植协会(IETA)制定标准进行胚胎发育阶段和质量等级的评定，选择桑黄胚至扩张囊胚。分为1、2、3级，1、2为可冷冻胚胎。1级：胚胎外形匀称，界限明显，透明带圆而平滑。2级：卵裂球有基本结构，比较紧密，但有个别游离细胞，透明带呈圆形。3级：细胞松散，细胞界限模糊，发暗。1

12、0. 2冷冻方法采用程序冷冻仪快速冷冻方法。11. 3溶液配置12. 3.1基础液Holding13. 3.2冷冻液Sl液:2ml1.5MEG+4mlHolding液混匀(Q5MEG)S2液：4ml1.5MEG+2mlHolding液混匀(1.0MEG)6.3.3解冻液Tl液：1.5mlL5MEG+1.5mlIMSU+1.5mlHolding（0.5MEG+0.33MSU）T2液：1.5向1MSU+3mlHolding（0.33MSU）6.4标记细管塞信息包括：品种、供体母羊名、细管序号、种公羊名、冷冻时间、冷冻数量。塑料桶信息包括：品种、供体母羊名、冷冻方法、种公羊名、冷冻时间Cane信息包

13、括：供体母羊名字、种公羊名、细管序号、冷冻时间6.5胚胎回收体外培养或体内生产的胚胎回收到装有HOIding液并编号的24孔平皿中，待冷冻。6.6冷冻6.6.1洗涤胚胎在Holding液滴中洗4次，然后在O.l%Trypsin液滴中过两滴，每滴中停留30秒,之后在Holding液中再洗5次。胚胎放入做好标记的6孔平皿，30分钟内必须开始冷冻。6.6.2平衡胚胎在Sl和S2液中平衡5分钟，在1.5M乙二醇中平衡10分钟。6.6.3装管I/IZlIZ/LzlIZ/123456以上为装管图示。左端为棉栓（未显示），右端为细管塞（未显示），1-4阴影部分均为1.5M乙二醇冷冻液，空白部分为气泡。各段长

14、度为1：25mm；2：3mm；3：20mm,装有胚胎；4：3mm；5：2Omm；6：不定，直到封满口。每只细管装1枚胚胎，最后塞入贴有标签的细管塞。6.6.4预冷每批冷冻细管数不超过15支。装好胚胎的细管在1.5MEG中平衡达10分钟时即放入冷冻仪中，在-6C平衡5分钟后植冰。6.6.5植冰采用两点植冰法。植冰工具为缠绕棉头的塑料棒（可用市售的化妆棉棒）。细管垂直放入冷冻槽，棉栓端（第一段液体）朝下。第一植冰点位于第一段液体紧靠棉栓之处，第二植冰点位于第五段液体中间。植冰一定要快而准，用植冰棉棒蘸饱液氮，将细管迅速提起至第1段液体，点第一植冰点后立即把细管降至第5段液体，点第二植冰点后立即将细

15、管放回原位。第一个植冰点出现冰点即可，第二个植冰点稍重。6. 6.6降温植冰后按下冷冻仪的RUN键，以0.3C/分钟的速率下降至-35C,平衡10分钟后投入液氮保存（在植冰前一定不能盖上冷冻仪的盖子，植冰后即盖好）。6.7贮存在盛满液氮的保温杯中将细管装入相应的塑料桶内，塑料桶固定于CANE中放入液氮罐中保存。6. 8解冻6.1.1 准备好盛满液氮的保温杯、盛满32水的保温杯、一个滴好Tl、T2和HOIding液的6孔平皿。6.1.2 胚胎细管从液氮中取出，空气浴2-3秒，之后将细管塞端朝下放入32。C水浴10秒。6.8.3把胚胎放入Tl液中平衡5分钟，然后把胚胎移入T2液中平衡5分钟，移入Holding中洗3次，备用。