甘蓝过氧化物酶基因的克隆及表达分析.docx

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1、甘蓝(BmssicaHemceaLvarcapitataL.)十字花科芸蔓属，典型的异花传粉植物。诸多学者经研究表明花粉败育的主要原因之一是绒毡层细胞的发育异常，绒毡层细胞降解的提前或者延迟都可导致雄性不育，花粉败育属于雄性不育的表现特征。同时也有研究表明过氧化物酶是影响绒毡层发育的一个重要因素。为了系统性的了解过氧化物酶基因在结球甘蓝的作用机制，以及系统结构和表达特点,本试验以结球甘蓝为研究对象，通过RT-PCR扩增出过氧化物酶基因；再通过生物信息学分析其结构和蛋白功能；构建过氧化物酶基因的亚细胞定位重组质粒为后期该基因的深度研究提供理论依据。研究结果表明,通过PT-PCR扩增出984bp的

2、BoPOD基因的CDS区。对该基因进行生物信息学分析结果表明，BoPOD蛋白为亲水性稳定蛋白，由327个氨基酸残基组成，含有PeroXidaSe结构域同时具有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点以及多个特异性激酶磷酸化位点，无信号肽。通过同源氨基酸序列比对和构建系统发育树发现结球甘蓝与甘蓝变种和欧洲油菜有很高的同源性。进行亚细胞定位预测该蛋白在胞外，可能属于分泌蛋白。表达分析得出，血尸。基因在甘蓝组织花中具有高表达量，在可育与不育甘蓝的发育阶段中，不同的发育阶段和可育与不育对比均有不同的表达量。并成功构建重组载体。本研究为该基因在甘蓝雄性不育的分子调控机理中的功能及调控作用研究提供了理论依据。关键

3、词：结球甘蓝；过氧化物酶；雄性不育；生物信息学AbstractBrassicaoleraceaL.var.capitataL.isagenusofbrassicainthecruciferousfamily,typicalofcross-pollinatingplants.Manyscholarshaveshownthatoneofthemaincausesofpollensterilizationistheabnormaldevelopmentofchorionyfeltlayercells,andtheearlyordelayeddegradationofchorionyfeltlayer

4、cellscanleadtomaleinfertility,andpollensepticisamanifestationcharacteristicofmaleinfertility.Atthesametime,studieshavealsoshownthatperoxidaseisanimportantfactoraffectingthedevelopmentofthevelvetfeltlayer.Inordertosystematicallyunderstandthemechanismofactionofperoxidasegeneincabbage,aswellasthesystem

5、structureandexpressioncharacteristics,thisexperimentamplifiedperoxidasegenebyRT-PCRwithkaleastheresearchobject.Itsstructureandproteinfunctionwerethenanalyzedbybioinformatics;TheconstructionofSubcellularlocalizationrecombinantplasmidsofperoxidasegeneprovidesatheoreticalbasisforthein-depthstudyofthisg

6、eneinthelaterstage.TheresultsshowedthattheCDSregionoftheBoPODgeneof984bpwasamplifiedbyPT-PCR.BioinformaticsanalysisofthegeneshowedthatBoPODproteinwasahydrophilicstableproteincomposedof327aminoacidresidues,containingPeroxidasedomains,withserine,threonineandtyrosinephosphorylationsitesandmultiplespeci

7、fickinasephosphorylationsites,withoutsignalpeptides.Throughhomologyaminoacidsequencealignmentandphylogenetictreeconstruction,itwasfoundthatkalehadhighhomologywithcabbagevarietiesandEuropeanrapeseed.Subcellularlocalizationpredictsthattheproteinisextracellularandmaybeasecretedprotein.Expressionanalysi

8、sshowedthatBoPODgenehadhighexpressionincabbagetissueflowers,anddifferentdevelopmentalstagesandsterileandsterilecomparisonhaddifferentexpressionamountsinthedevelopmentstagesoffertileandsterilecabbage.Andsuccessfullyconstructedtherecombinantvector.Thisstudyprovidesatheoreticalbasisforthestudyofthefunc

9、tionandregulatoryroleofthisgeneinthemolecularregulationmechanismofmaleinfertilityincabbage.Keywords：Brusselssprouts;Peroxidase;Maleinfertility;Bioinfbrmatics1绪论1.1 研究背景典型的十字花科芸蔓属植物甘蓝，具有很强的抗逆环境的性能和强的适应能力，其叶球中含有丰富的营养价值，受到人们广泛的关注和喜爱，在世界各地普遍栽培。近年来，我国实现了利用雄性不育系技术对甘蓝进行规模化制种，完成了甘蓝育种高效技术体系的建立；同时针对甘蓝的一些重要基因进

10、行了克隆或定位，培育出一批具有优良品质和抗逆性的新品种甘蓝；为后期甘蓝的研究指出重要问题并指明未来的发展方向“司。甘蓝为典型的异花授粉作物,其一代杂种在抗病性、抗逆性、品质、生长势及产量等方面具有十分显著的杂种优势；甘蓝的杂种生产主要依托自交不亲和系和雄性不育系两种途径现对甘蓝的育种研究表明，利用自交不亲制种会造成人力、物力及财力等方面的很大程度的浪费，但选用雄性不育系进行制种可以避免这种弊端。细胞核雄性不育、细胞质雄性不育、核质互作雄性不育、基因型一一环境互作不育这四大类的划分，是我国学者对甘蓝雄性不育的划分。在结球甘蓝中发现的不育自然突变，是我国特有的类型，现已经应用于甘蓝杂交优势的利用。

11、诸多学者经研究获知花粉败育是雄性不育的表现特征，并表明绒毡层细胞发育异常是其主要原因09,绒毡层细胞降解的提前或者延迟都将导致雄性不育。线粒体的呼吸作用异常、物质代谢紊乱、膜脂过氧化和小RNA功能异常等都与花粉败育有着密切的关联。绒毡层PCD（细胞的程序化死亡）过程的异常，使得过氧化物酶（P。）的活性发生了异常，产生大量的H2O2无法及时正常清除，从而对蛋白质的合成起到了抑制作用“】。此时正处于小胞子内生化反应最活跃的时期，核进行有丝分裂的时期，从而蛋白质的缺失最终将导致核发育畸形，致使花粉败育UL在高等植物中分布较为广泛的过氧化物酶，是植物重要的保护酶，在植物的正常生长和应激反应中都发挥着重

12、要作用U根据过氧化物酶的不同结构将其分为：胞内过氧化物酶、胞外过氧化物酶、分泌过氧化物酶这三类1。植物的血红素依赖性过氧化物酶属于分泌过氧化物酶,催化涉及过氧化氢作为电子受体的多步氧化过程反应,含有4个保守的二硫键和2个保守的钙结合位点【网。它参与酚类物质氧化，在果蔬褐变中发挥着重要作用。同时在萝卜雄性不育系和保持系的过氧化物酶同工酶分析中，发现过氧化物酶基因与萝卜雄性不育系花的败育有关闻。1.2 研究目的及意义17世纪左右甘蓝传入中国进行种植并对其进行了大量研究，取得了优异的成果;在本世纪雄性不育系的研究与利用获得巨大成就,经过300多年来的发展,在蔬菜对外贸易出口国外和周年供给两大方面甘蓝

13、占据重要地位，目前国内的种植面积已经约90万hm2o我国大力发展甘蓝种植业，同时推动对甘蓝遗传变种获得突破，实现了FI制种由自交不亲和系到雄性不育系的技术变革，抗新型流行性病害育种取得了突破性进展，小袍子培养和分子标记辅助选择等生物技术逐步实用化，很大程度提高了育种效率1。虽然近年来对甘蓝的研究已经取得了一定的成功，但是应用于生产种植方面的甘蓝品种在抗病虫害、抗逆与优质品种的结合方面依然缺乏，不能完全满足生产和市场的需要。且遗传方面的资源任然有较大空缺，尤其是抗逆、抗病、优质三大方面优异资源的缺乏，传统育种和生物新技术还未很好的相互结合。目前已有结球甘蓝过氧化物酶同工酶的一些生化和遗传特性研究

14、，以及过氧化物酶活性及其影响因素的研究皿,81o但过氧化物酶基因在甘蓝的生长发育中有着不可替代的作用，若能对甘蓝过氧化物酶基因(BoPOD)进行系统的研究，便能为后期甘蓝雄性不育的分子调控机理中的功能及调控作用研究奠定基础，并为甘蓝杂种优势利用提供参考。所以本文将对过氧化物酶克隆体系、表达分析、重组载体构建三个方面进行系统分析研究。2材料与方法2.1 试验材料本课题组田间种植结球甘蓝，其花序、嫩角果、茎、叶四个组织；以及可育与不育甘蓝花蕾，分别具有为一级（花粉母细胞时期：O-Imm）、二级（四分体时期：l-2mm）、三级（单核花粉期：2-3.5mm）花蕾；可育花序、不育花序、可育嫩角果。2.2

15、 试验试剂与器材TIANGEN植物总RNA提取试剂盒、TIANGENCDNA第一链合成试剂盒、VaZymeTaqDNA聚合酶2XR叩idTaqMasterMix、ddH2OTIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、液氮、琼脂糖、EB、Tris、EDTA.蒸僧水、无水乙醇、DNA引物（上海生工生物工程有限公司）、TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、TIANGEN质粒小提试剂盒、VaZyme同源置换试剂盒ClonExpress（B）OneStepCloningKit、NEB的限制性内切酶Xbal、BamHl和T4DNA连接酶、Biotopped的硫酸卡那霉素（kanamycin,Kan）dd

16、H2O（中科瑞泰）D2000和D15000,（中晖赫彩）6XDNA上样缓冲液，（SangOnBioIeeh）大肠杆菌DH5,PFGC-eGFP载体为本试验室保存菌株PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、切胶仪、超低温冰箱、冰箱、烘箱、制冰机、顺时离心机、低温高速离心机、天平、微波炉、NANODROP2000仪、金属空气浴、涡旋震荡仪、高压灭菌锅、高温灭菌锅灭菌处理的研钵、药匙、镒子、剪刀、枪头、1.5ml离心管、PCR管，不同规格的移液枪、量筒、烧杯、橡胶手套、一次性塑料手套、酒精棉、口罩、玻璃棒、锡纸、报纸2.3 试验方法2. 3.1甘蓝过氧化物酶基因CDS克隆（1） RNA的提取严格按照植物总RNA试剂盒的说明书以及注意事项进行RNA提取，材料选用甘蓝的四个组织、可育与不育的不同级别的花蕾以及可育花序、不育花序、可育嫩角果。将提取的RNA置冰上，利用NANODRe)P2000仪测其浓度与纯度做好标记，-80C冰箱保存。试验过程中离心机一直保持4,使用RNA专用枪