分子生物讲义：第五章 基因诊断和基因治疗.ppt

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1、第五章第五章 基因诊断和基因诊断和基因治疗基因治疗基因诊断n应用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测分析致病基因的存在、变异和表达状态从而对疾病作出诊断的诊断技术 诊断技术进展n细胞学检查：第一代，早期n生化指标分析：第二代，50年代n免疫学诊断：第三代，60年代 以疾病的表型改变，如细胞形态结构 变化、生化代谢产物异常、特定蛋白质分子识别差异等为依据进行疾病诊断 n基因诊断：第四代，70年代 直接以病理基因为探查对象 基因诊断 的优点n早期诊断早期诊断：被检测的基因是否处于活化表达状态并不重要。因此，基因诊断不仅可对有表型出现的疾病作出明确诊断，它还可产前早期诊断遗传性疾病，可检出感染疾

2、病潜伏期的病原微生物、还可能予测和早期发现某些恶性肿瘤。n灵敏度高灵敏度高：可从人类长达3106kb的基因组中检测单拷贝基因，可检出某一基因的单碱基改变。n 基因诊断的基本技术一、核酸分子杂交技术n核酸分子杂交系指不同来源的两条互补核酸单链，在一定条件下形成双链分子的过程。核酸分子杂交发生于两条DNA单链之间者（ssDNA:ssDNA）叫DNA杂交。发生于RNA链与DNA单链之间者（RNA:ssDNA）叫做RNA-DNA杂交。将一段已知的带有标记物的核苷酸序列（核酸探针）与待测DNA/RNA杂交即可测知致病基因的存在状态。（一）原位（in situ）杂交 n不须提取DNA或RNA。直接用培养/

3、采集的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固定载玻片上）和细菌菌落（复印至泸膜上）与标记核酸探针杂交。可测知特定基因的存在或表达状况。还可观察被测基因在细胞内或染色体上的定位。（二）斑点印迹（Dot blot）杂交 n把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜（下同）上与标记核酸探针杂交。可检测特定基因的存在或表达情况。Southern印迹杂交 n系将DNA经限制性酶切、凝胶电泳后，再转移至膜上与标记探针杂交的一种核酸分子杂交技术。其分析的特异性、敏感性、准确性俱佳。它可检出哺乳动物总基因组中的单拷贝基因。主要用于检测基因组中特定的基因或序列。Northern印迹杂交 n是把RNA经凝胶

4、电泳转移至膜上与标记核酸探针杂交的技术。是分析基因表达水平的主要技术之一。它可定性、定量测知某一特定基因的表达情况。二、PCR技术（一）DNA PCR n以DNA为模板，扩增特定核苷酸序列。主要用于检测特定基因或DNA片段的存在。并常与核酸分子杂交结合，分析鉴定基因突变。（二）RT-PCR n用提取的mRNA或总RNA（含mRNA）为模板，逆转、扩增cDNA。是检测特定基因表达水平的主要方法之一。也是用于鉴别、诊断RNA病毒的重要技术。（三）PCR-SSCP n该技术是基于不同的单链DNA（即使只差一个碱基）有不同的空间构象，即DNA单链构象多态性(Singer Strand conforma

5、tion polymorphysim,SSCP)。n这些不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率是不同的。据此，将PCR扩增产物变性成单链DNA，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可测知DNA碱基序列有无变异。n在基因诊断中它常与核酸序列分析配合完成基因突变分析。即先用PCR-SSCP进行大批量筛查。筛出有突变的样本（PCR产物）再测序即可明确该基因的突变性质。（四）原位PCR n直接用组织切片和细胞进行PCR或RT-PCR反应，在组织、细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列。n既能鉴定含有靶DNA/RNA序列的细胞；又能确定靶DNA/RNA序列在细胞内或染色体上的位置。（五）多

6、重PCR n系在一次PCR反应中加入多对引物，同时扩增DNA链上不同序列段的一种PCR技术。主要用于一些“超大”基因中大片段缺失分析。nDMD：9对扩增引物加入一次PCR反应体系中，同时扩增9个外显子序列。由于扩增产物片段大小不一，只需琼脂糖凝胶电泳、EB染色即可直接观测有无某一外显子区带缺失。n是诊断基因缺失型的一种简便、快速、有效的基因诊断方法。（六）定量PCR nPCR产物经凝胶电泳分离转移至膜上，与同位素或化学发光标记的核酸探针杂交。根据放射自显影或化学发光后底片曝光的强弱，用密度计扫描定量。有条件者，PCR产物经凝胶电泳分离后勿须转移和杂交，直接于自动凝胶分析仪上扫描定量。最为简便、

7、快速。定量PCR在基因诊断中也是应用较广，有时甚至是不可缺少的。三、DNA序列分析n DNA测序是直接分析待测基因核苷酸序列的方法。是基因诊断中最为直观，准确可靠的技术。只是由于测序工作还较费时，经费亦较贵尚不能普遍应用。但随着DNA自动测序仪的快速发展和测序工作日趋商业化，将大大促进DNA测序的临床应用。四、RFLPS分析n限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length polymorphism,RFLP)是由于某些个体DNA链中核苷酸序列发生变异的结果。这种变异使某些限制性内切酶消化产生与正常个体者不同的DNA片段长度。当这些变异影响到基因的正常功能时，往往是

8、致病性的。nRFLP主要有以下两种类型：点多态性 序列多态性 1.点多态性 n表现为DNA链中发生单碱基突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。这类多肽性实际是双态的，即有或无酶切位点。据此，样品DNA经特定内切酶消化和Southern印迹杂交即可诊断某些疾病。2.序列多态性 nDNA链内发生较大片段的缺失、重复、插入等变异。结果，内切酶位点本身碱基序列虽未改变，但原有内切酶位点在基因组中的相对位置改变了从而导致RFLP。亦可用Southern印迹杂交诊断相关疾病。基因诊断的应用 一、遗传性疾病的基因诊断n针对某一遗传病的发生机理，通过基因诊断技术进行携带者检查、产前早期

9、诊断，采取有效措施杜绝患儿出生，降低该遗传病基因的发生频率具有极积的现实意义。二、病毒性疾病的基因诊断n只要掌握了病原体的基因结构，几乎所有的原病体都可用基因诊断方法检出。n无论设计合成杂交探针或PCR引物序列，应选择来自病毒基因组核酸保守序列。典型保守序列编码的蛋白质往往是病毒生命周期中的重要功能蛋白，特异性更强。三、寄生虫病的基因诊断n由于寄生虫的基因组结构功能远比细菌、病毒复杂多样。因此，一种寄生虫能否采用基因诊断，则取决于在其宠大的基因组序列中能否找到特异的靶序列。根据这些靶序列才能设计制备特异性的杂交探针和PCR引物。目前用基因诊断可检测的寄生虫有恶性疟原虫、克鲁斯锥虫、利什曼原虫、

10、马来丝虫、血吸虫、弓形虫等。四、基因诊断在法医学中的应用n法医学中对生物样本检测的主要目的是达到个人识别和亲子鉴定 n80年代以来，以核酸分子杂交和PCR技术为核心的基因诊学的迅速发展，有逐渐取代传统法医物证鉴别法的趋势n 法医学基因诊断的分子基础是基于人类基因组结构中存在一些可作为个体特征标示的序列 个体特征标示序列 n可变数串联重复序列n短串联重复序n线粒体DNA非编区（一）可变串联重复序列多态性分析 n可变串联重复序列（VNTR）属高度重复序列 nVNTR内的“核心序列”（重复单元）长10-70bp。不同个体基因组上同一VNTR位点的核心序列相同，但重复次数相差悬殊。故不同个体间同一位点

11、VNTR区DNA片段长度变化较大，在群体中呈多态性，即VNTR长度片段多态性。NVTR长度片段多态性就为法医学中的个体识别提供了有力证据 VNTR长度片段多态性的检测方法nDNA指纹图谱法 n扩增片段长度多态性（Amp-FLP）1.DNA指纹图谱法 n利用VNTR序列中无切点的限制性内切酶如Hinf I，酶切基因组DNA后，形成长短不等的许多DNA片段。电泳分开不同大小的DNA片段。用VNTR核心序列作为标记探针进行Southern印迹杂交。不同个体出现一系列不同的杂交带型。从而做出个体识别或指证确认罪犯。2.扩增片段长度多态性 n其基本原理是设计一对与VNTR区两侧保守区互补的PCR引物，对

12、VNTR区DNA进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖/聚丙烯酰胺凝胶电泳、EB/AgNO3染色即可直接判型（二）短串联重复序列多态性分析 n 短串联重复序列（Short tandem repeat,STR）又称微卫星DNA。STR是由2bp-10bp重复单元组成的短串联重复序列。片段长100bp-500bp。STR广泛分布于人类基因组。据估计，人类基因组每20kb就有一个3bp或4bp串联重复序列的STR位点。nSTR用于法医学检测，具有以下优点：不需要杂交。只要设计出STR两侧DNA引物对待检样本DNA进行简单的PCR，即可根据电泳谱带认定或排除罪犯。由于STR广泛分布于整个基因组，可分析部分降

13、解的DNA。STR序列较短，各位点STR扩增条件相差不大，可对几个STR位点进行同步扩增，即STR-PCR复合扩增技术，以省时、节约检材、提高识别机率。n（三）PCRmt DNA分析 nmt DNA存在于细胞质中。其遗传方式为母系遗传。n一个细胞一般含有数百个线粒体，而每个线粒体则含有210个mt DNA拷贝。一个细胞可达几千个mt DNA拷贝。mt DNA分析的灵敏度要比DNA高。n 研究表明，不同个体mt DNA非编码区D环附近序列存在着明显差异。用PCR扩增、测序，可进行个人识别。基因治疗 n将外源基因导入目的细胞并有效表达，从而达到治疗疾病的目的 基因治疗的策略n基因置换就是将致病基因

14、整个地换以正常基因，使致病基因永久地得到更正。n基因修正是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。n基因修饰是指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物饰变缺陷细胞的功能或使原有的功能特别加强。n基因失活就是应用反义技术（antisense technology）特异封闭某些基因，以达到抑制某些有害基因的表达 基因治疗的程序基因治疗的程序n目的基因的获得，靶细胞的选择以及将目的基因导入靶细胞的高效手段 一、目的基因的获得一、目的基因的获得目的基因可以是染色体基因组，也可以是互补DNA，即cDNA。n基因的人工合成n基因的多聚酶链反应扩增（polymerase chain

15、 reaction,PCR）n以及人体基因组的降解n基因的克隆化二、基因治疗的靶细胞二、基因治疗的靶细胞n 基因治疗的靶细胞有两类，即生殖细胞和体细胞。现今基因治疗仅限于体细胞，基因型的改变也仅影响某个体当代。n基因治疗中，选择什么样的细胞作为基因转染的靶细胞，是基因治疗成功与否的一个重要途径。选择时除要考虑疾病本身的特点外，还要考虑目的基因及其转移方法等因素。选择时要考虑：（一）发病的器官及位置n根据表现基因缺陷的器官及其位置来选择基因治疗的靶细胞。可以选择病变本身器官的细胞，也可以选择病变器官以外的细胞来作为基因治疗的靶细胞。例如肝脏病的基因治疗中，可以选择肝细胞作为基因治疗的靶细胞，同时

16、肝癌的治疗，也可选择肝癌组织中浸润的淋巴细胞作为其靶细胞，有时甚至肿瘤细胞也作为靶细胞的候选对象。（二）发病机制 n家族性高胆固醇血症（FH）患者，血中胆固醇水平很高，绝大部分在20岁之前就发展成为严重的动脉粥样硬化而致死，但其病因却是肝细胞膜上缺乏低密度脂蛋白受体（LDL-R），肝细胞摄取血中胆固醇的能力下降或完全丧失，造成低密度脂蛋白的代谢障碍。因此，FH病人如进行基因治疗，应选择肝细胞作为靶细胞，导入LDL-R的基因，使肝细胞膜上的受体得到表达，提高其对血中LDL的处理能力。（三）体内屏障结构 n血脑屏障的存在，可阻挡许多大分子物质进入中枢神经系统。中枢神经系统的疾病进行基因治疗要保证选择的靶细胞中目的基因表达产生可在中枢神经系统发挥作用。一方面选择中枢神经系统本身的细胞种类作为其基因治疗的靶细胞，也可将其他部位的细胞转化后进行中枢神经系统移植。总之要避开血脑屏障对目的基因表达产物运输的障碍，目的基因表达产物进不了中枢神经系统，往往很难发挥其作用，而达不到基因治疗的目的。（四）容易取出和移植n最容易取出和移植的细胞当属血液系统的细胞种类。人的血液红细胞（RBC），淋巴细胞，造血干