分子生物学诊断技术进展.ppt.ppt

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1、1分子生物学诊断技术进展分子生物学诊断技术进展2主要内容：主要内容：l分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用l简单介绍实验原理简单介绍实验原理l以以PCR、荧光实时定量、荧光实时定量PCR、NASBA为例为例l分子诊断技术在以下病原研究的应用进展分子诊断技术在以下病原研究的应用进展l乙型肝炎乙型肝炎l丙型肝炎丙型肝炎l结核分枝杆菌结核分枝杆菌3病原学检测常用的实验室技术病原学检测常用的实验室技术l细胞培养与鉴定（细胞培养与鉴定（“金标准金标准”）、动物实验）、动物实验l血清学、免疫学诊断技术血清学、免疫学诊断技术l电镜技术电镜技术4分子生物学诊断技术方法简

2、介分子生物学诊断技术方法简介1、主体技术、主体技术具体方法举例具体方法举例 循环扩增循环扩增PCR（聚合酶链反应）（聚合酶链反应）Real-time PCR,RT-PCR，巢式PCR，复合PCR PCR-ELISA，微孔板杂交，荧光探针标记法LCR（连接酶链反应）（连接酶链反应）恒温恒温NASBA（依赖核酸序列的扩增，主要用于（依赖核酸序列的扩增，主要用于RNA）SDA（链置换扩增术）（链置换扩增术）CPT（环状探针技术（环状探针技术）bDNA（枝链核酸信号放大系统（枝链核酸信号放大系统）杂交捕获杂交捕获（如：检测（如：检测HPV-DNA的试剂盒）的试剂盒）5分子诊断技术方法简介2、多标靶同时

3、检测、多标靶同时检测l多重多重PCRl毛细管电泳毛细管电泳l以测序分析为基础的检测技术以测序分析为基础的检测技术6分子诊断技术方法简介3、核酸杂交、核酸杂交lDNA荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）l将标记的探针直接原位杂交到染色体或将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测检测DNA序列在染色体或序列在染色体或DNA纤维上的定位。纤维上的定位。l线性探针分析法（线性探针分析法（LiPA）l杂交保护分析法（杂交保护分析法（HPA）4、质谱、质谱l利用色、质谱

4、结合利用色、质谱结合PCR技术技术7分子诊断的功能及扩展分子诊断的功能及扩展l病原的诊断和鉴别诊断病原的诊断和鉴别诊断l病原分型病原分型l病毒载量监测病毒载量监测-个体化治疗的依据个体化治疗的依据l疗效及预后标志疗效及预后标志l其他：病原感染中发生、发展各阶段其他：病原感染中发生、发展各阶段8分子诊断的功能及扩展l疾病分型及意义疾病分型及意义例如：例如：HPV（30/100）高危高危-16，18，31，45 低危低危-6，119分子诊断的功能及扩展l病毒载量与治疗病毒载量与治疗 例例1.-北京地坛医院谢尧提供10分子诊断的功能及扩展l病毒载量与治疗病毒载量与治疗例例2.HBV-干扰素干扰素HB

5、V100pg/mL 1/30 阴转阴转(HBeAg HBeAb)11分子诊断的功能及扩展l病毒载量与治疗病毒载量与治疗例例3.HIV病毒载量与传播病毒载量与传播15127人人 流行病学调查流行病学调查415对伴侣对伴侣30个月个月HIV阳转阳转22%（90/415）51人人RNA1500copies/mL 全阴全阴12分子诊断的功能及扩展l病毒载量与治疗病毒载量与治疗例例4.血浆血浆EBV载量与鼻咽癌复发载量与鼻咽癌复发15个二年持续缓解：个二年持续缓解：0 copy/mL10个复发：个复发：32250 copies/mL17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高个随访：临床恶化前半年病毒载量升高

6、13耐药病原的分子诊断耐药病原的分子诊断lWHO：人类死亡：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用是长期用药的毒副作用lHBV的的YMDD变异变异lHIV耐药耐药14血制品筛查血制品筛查l300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：余万的血清阴性样品，分子生物学复测：HBV：47HCV：10HIV-1：2 -2001年剑桥资料年剑桥资料 lHIV-1血清阴性而血清阴性而RNA阳性阳性 0.2-6.6%-Am.J.Chin Athol.200015l 在基础研究领域中的应用；在基础研究领域中的应用；l 遗传病的基因诊断和产前基因诊断：遗传病的基因诊断和产前基因诊断：如血友病、地中海贫血等如血友病、地中

7、海贫血等l 肿瘤基因和肿瘤标志物表达肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)(mRNA)的检测；的检测；l 骨髓移植、器官移植供体配型选择；骨髓移植、器官移植供体配型选择；l 法医学、动植物学、古人类学、古生物学；法医学、动植物学、古人类学、古生物学；l 与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测；素、受体）的基因表达的检测；l 药物基因组学、耐药基因的检测，等等药物基因组学、耐药基因的检测，等等分子生物学技术在其它领域的应用分子生物学技术在其它领域的应用16简单介绍实验原理简单介绍实验原理lPCR(Polymerase Chain Re

8、action,(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应聚合酶链反应)l荧光实时定量荧光实时定量PCR（real time PCR）lNASBA（依赖核酸序列的扩增）（依赖核酸序列的扩增）17PCRPCR原理原理:实质就是实质就是体外基因体外基因复制复制技术技术Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA聚合酶聚合酶 AmpErasePrimer靶序列靶序列加热变性加热变性95 C靶序列引物退火靶序列引物退火55 C引物延伸引物延伸72 C18PCR PCR 循环循环 第一步第一步 加热变性加热变性靶序列靶序列从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的从外周血白细胞

9、或绒毛、羊水细胞提取的DNADNA约约1ug1ug，在含有，在含有适当缓冲液、引物、适当缓冲液、引物、dNTPsdNTPs（dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP及及dTTPdTTP）等的）等的反应混合物中，在反应混合物中，在9494下热变性下热变性1-41-4分钟，使之解为单链。分钟，使之解为单链。19PCR PCR 循环循环第二步第二步引物与靶序列退火引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533引物与解为单链的引物与解为单链的DNADNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。上互补序列杂交在一起，称之为退火。5555左右左右

10、20PCR PCR 循环循环 第三步第三步 -引物延伸引物延伸靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerase在在DNADNA聚合酶催化作用下，以聚合酶催化作用下，以dNTPsdNTPs为原料（底物），从引物的为原料（底物），从引物的3 3端端A A开始开始,沿着沿着5 533的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。7272左右左右21第1个PCR循环完成后靶序列 靶序列BiotinBiotin223030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.Ampl

11、icon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 Amplicon2353RQ探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，所以检测不到荧光，此种现象称为所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。荧光共振能量

12、转移。荧光荧光PCRPCR原理原理 TaqManTM技术技术24535353RQExtension Step531.Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52.Cleavage3.PolymerizationComplete53QTaqR354.Detection533QTaqR5lR荧光荧光PCRPCR原理原理 TaqManTM技术技术25l定量定量PCR测定的是扩测定的是扩增的指数扩增期增的指数扩增期;l定性定性PCR测定的是扩测定的是扩增的终点（平台期）增的终点（平台期）定量定量PCRPCR与定性与定性PCRPCR测定的区别测定的区别26市场上常见的实时荧光

13、市场上常见的实时荧光PCR仪仪罗氏LightcyclerMJ opticon2伯乐icyclerABI7000杭州博日（原大和）linegene27临床标本临床标本核酸提取技术核酸提取技术NASBA 扩增扩增ECL-化学发光标记检测化学发光标记检测NASBA 扩增扩增+分子灯塔检测分子灯塔检测扩增过程中扩增过程中“分子灯塔分子灯塔”即即时同相检测时同相检测 方法方法 1-NucliSens ECL方法方法 2-NucliSens EasyQ加入裂解缓冲液和内置标准加入裂解缓冲液和内置标准NASBA测定原理28NASBA扩增原理引物引物 1逆转录酶逆转录酶RNase H引物引物 2逆转录酶逆转录

14、酶T7 RNA 聚合聚合 酶酶引物引物 2逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶RNase H引物引物 1线性循环线性循环扩增循环扩增循环29NASBA 和 PCR 的不同NASBANASBAv 扩增目标为扩增目标为RNAv 同温扩增同温扩增v 连续扩增连续扩增v 扩增物为单链扩增物为单链RNAv 引物次序不包含於最终产物中引物次序不包含於最终产物中PCRv 扩增目标为扩增目标为DNAv 温度循环扩增温度循环扩增v 循环扩增循环扩增v 扩增物为双链扩增物为双链DNAv 引物次序包含於最终产物中引物次序包含於最终产物中30乙型肝炎检测标志物：乙型肝炎检测标志物：lHBsAg，抗-HBs,lHBeAg，

15、抗-Hbe,l抗HBc (IgG,IgM),lHBV-DNADane颗粒（完整的病毒）形态颗粒（完整的病毒）形态乙型肝炎的分子诊断乙型肝炎的分子诊断31乙型肝炎的分子诊断乙型肝炎的分子诊断1.重要性重要性l全球全球 20亿人感染亿人感染l慢性慢性 3.5亿人亿人l中国、东南亚、非洲中国、东南亚、非洲50肝硬化，肝硬化，70-90肝癌肝癌l7-30携带者感染变异体携带者感染变异体322.HBV基因型与血清型关系及流行病学分布基因型与血清型关系及流行病学分布l基因型与血清型不完全一致基因型与血清型不完全一致l临床突变率不同临床突变率不同l有地域分布特点有地域分布特点乙型肝炎的分子诊断乙型肝炎的分子

16、诊断33表1：基基因因型型血清学亚型血清学亚型基因长基因长度度(nt)临床突变率临床突变率主要主要流行地域流行地域PC*(G1896A)BCP*(1762/1764)Aadw2ayw132216.5（少）（少）C185845（常）（常）西欧、北欧、西欧、北欧、北美、中非、北美、中非、印度印度Badw2ayw1321550（常）（常）T185816东南亚、中国、东南亚、中国、日本日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321550（常）（常）T1858或或C185858（常）（常）东南亚、中国、东南亚、中国、日本、澳洲、日本、澳洲、美国美国Dayw2;ayw3;ayw4318243%(常）常）T185812（低）（低）地中海、俄罗地中海、俄罗斯、印度、美斯、印度、美国国34表1(续）:基基因因型型血清学亚型血清学亚型基因基因长度长度(nt)临床突变率临床突变率主要主要流行地域流行地域PC*(G1896A)BCP*(1762/1764)Eayw4321227（中）（中）7（低）（低）西非西非Fayw4;adw2;Adw4q-321516（少）（少）C1858未定未定中美、南美