第3章 多肽与蛋白质类药物.ppt.ppt

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1、u1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽年人工合成了第一个有生物活性的多肽催产素催产素以后，以后，20世纪世纪50年代都集中于脑垂体所分泌的各种多年代都集中于脑垂体所分泌的各种多肽激素肽激素的研究。的研究。u60年代，研究的重点转移到控制脑垂体激素分泌的各种年代，研究的重点转移到控制脑垂体激素分泌的各种多肽激素的研究。多肽激素的研究。u70年代，年代，神经肽神经肽的研究进入高潮。生物胚层的发育渊源的研究进入高潮。生物胚层的发育渊源关系表明，很多脑活性肽也存在于肠胃组织中，从而推关系表明，很多脑活性肽也存在于肠胃组织中，从而推动了肠胃激素研究的进展。动了肠胃激素研究的进展。3.1 多肽和蛋白

2、质药物基本知识多肽和蛋白质药物基本知识p基本概念基本概念u多肽类多肽类药物是以多肽药物是以多肽激素激素和多肽和多肽细胞生长因子细胞生长因子为主的为主的一大类内源性活性成分。一大类内源性活性成分。u蛋白质蛋白质药物包括药物包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白、蛋白酶抑因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白、蛋白酶抑制剂制剂等，其作用方式从对机体各系统和细胞生长的调等，其作用方式从对机体各系统和细胞生长的调节，扩展到被动免疫、替代疗法和抗凝血等。节，扩展到被动免疫、替代疗法和抗凝血等。u细胞生长调节因子细胞生长调节因子在体内和体外对

3、效在体内和体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类物质。一类物质。u许多生长因子在靶细胞上有特异性受体，许多生长因子在靶细胞上有特异性受体，仅微量就有较强的生理活性。仅微量就有较强的生理活性。3.1 多肽和蛋白质药物基本知识多肽和蛋白质药物基本知识生物技术在该类中的应用生物技术在该类中的应用p基因工程技术制造基因工程技术制造-胰岛素、干扰素、白介素、生胰岛素、干扰素、白介素、生长素、长素、EPO等实现了工业化，发展方向为转基因动植物等实现了工业化，发展方向为转基因动植物A.许多活性蛋白质、多肽都是由无活性的蛋白质前体，经许多活性蛋白质、多肽都是由无活

4、性的蛋白质前体，经过酶的加工剪切转化而来的有过酶的加工剪切转化而来的有共同的来源，相似共同的来源，相似的结构的结构，保留着若干彼此所特有的生物活性。研究活性多肽结，保留着若干彼此所特有的生物活性。研究活性多肽结构与功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的构与功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的关系，将关系，将有助于设计和研制新的活性多肽药物。有助于设计和研制新的活性多肽药物。B.对蛋白质类药物进行结构修饰对蛋白质类药物进行结构修饰u按来源分按来源分生化药物生化药物来源于动植物有机体来源于动植物有机体基因工程药物基因工程药物来源于基因工程菌表达生产的来源于基因工程菌表达生产的药物药物

5、u习惯分法习惯分法多肽生化药物、细胞生长因子、抗体药物、抗菌多肽生化药物、细胞生长因子、抗体药物、抗菌肽、酶类药物肽、酶类药物多肽、蛋白质类药物分类多肽、蛋白质类药物分类多肽类激素、多肽抗生素：多肽类激素、多肽抗生素：消化道多肽、下丘脑消化道多肽、下丘脑多肽、脑多肽、激肽等；动、植物蛋白。多肽、脑多肽、激肽等；动、植物蛋白。酶类与辅酶类药物：酶类与辅酶类药物：蛋白水解酶类、凝血酶及抗蛋白水解酶类、凝血酶及抗栓酶，辅酶栓酶，辅酶Q10等。等。生化药物生化药物激素类及神经递质类药物：激素类及神经递质类药物：人生长激素释放抑制因子，人生长激素释放抑制因子，人胰岛素，人生长激素人胰岛素，人生长激素细胞

6、因子类药物：细胞因子类药物：人干扰素，人白细胞介素，集落刺激人干扰素，人白细胞介素，集落刺激因子，促红细胞生成素因子，促红细胞生成素酶类及凝血因子类药物：酶类及凝血因子类药物：单克隆抗体、疫苗、基因治疗单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、白介素、生长因子、内啡肽、反义药物、人生长药物、白介素、生长因子、内啡肽、反义药物、人生长激素、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子等。激素、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子等。基因工程药物基因工程药物多肽和蛋白质的物化性质多肽和蛋白质的物化性质1.酸碱性酸碱性p多肽是小分子，化学性质与氨基酸类似，含有多肽是小分子，化学性质与氨基酸类似，含有20个以上氨基酸残基的多肽与蛋白质

7、没有明显个以上氨基酸残基的多肽与蛋白质没有明显界限；界限；p蛋白质是呈两性解离的电解质，通常在等电点蛋白质是呈两性解离的电解质，通常在等电点时，蛋白质的溶解度最小，不稳定，易于从溶时，蛋白质的溶解度最小，不稳定，易于从溶液中沉淀析出。液中沉淀析出。p各种蛋白质分子都有自己的等电点。各种蛋白质分子都有自己的等电点。2.离子结合离子结合n蛋白质存在两性，其表面带有一定量的电荷，蛋白质存在两性，其表面带有一定量的电荷，可与阴离子或阳离子结合。可与阴离子或阳离子结合。n很多离子与蛋白质形成不溶性的盐，可作为蛋很多离子与蛋白质形成不溶性的盐，可作为蛋白质的沉淀剂。白质的沉淀剂。多肽和蛋白质的物化性质多肽

8、和蛋白质的物化性质多肽和蛋白质的物化性质多肽和蛋白质的物化性质3.胶体性质胶体性质l蛋白质分子量大，分子大小达到胶粒1100nm范围。l球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈地吸引水分子作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围，称水化膜水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。l蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大，在分离提纯蛋白质过程中，可利用蛋白质的这一性质除去小分子杂质透析透析(dialysis)。4.变性变性天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生生物学活性的丧失物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性，称

9、之为蛋白质的变性作用变性作用(denaturation)。变性蛋白质和天然蛋白质最明显的区别是溶解度降低溶解度降低变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性复性。多肽和蛋白质的物化性质多肽和蛋白质的物化性质3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法多肽和蛋白质药物的生产方法u利用传统的生化提取法生产利用传统的生化提取法生产 从动植物、微生物等直接提取 通过培养动植物、微生物的细胞得到u利用基因工程技术构建工程菌（细胞）进行生产利用基因工程技术构建工程菌（细胞）进行生产 利用原核生物或简单的真核生物如酵母菌作为工程菌（

10、活细胞），通过将含有编码某蛋白或多肽的碱基序列插入一段DNA载体（如质粒）中，并在工程菌（或细胞）中表达，从而得到相应的多肽或蛋白质。n加拿大SembioSys生物工程公司利用北美洲普遍栽培的高产油料作物红花作为转基因植物“平台”，成功生产出“红花子来源人胰岛素红花子来源人胰岛素”，n该胰岛素顺利通过动物实验与期临床试验，其药代动力学与药效学试验结果与美国礼来利用大肠杆菌表述胰岛素基因生产的重组DNA人胰岛素基本一样。n理论上，每公顷红花田可生产出1公斤人胰岛素原料药。3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法多肽和蛋白质药物的生产方法p加拿大渥太华大学生物技术研究中心的科研人员也利用另两种高产作物烟

11、草和水稻植株生产出了一种名为“胰岛素样生长因子胰岛素样生长因子”(ILGF)的新型降血糖药物。p据称，ILGF的降糖效果甚至优于常规口服降糖药。p如果ILGF能通过临床试验并成功上市，或将成为前景可期的国际医药市场畅销产品。3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法多肽和蛋白质药物的生产方法蛋白质、多肽提取分离常用的方法：蛋白质、多肽提取分离常用的方法：l沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、结晶等）l超滤法l膜分离法l离心分离法l凝胶过滤法l离子交换层析l疏水相互作用色谱l亲和层析等3.3 多肽和蛋白质药物的分离多肽和蛋白质药物的分离基因工程药物分离与纯化的流程基因工程药物分离与纯化的流程用用C4

12、C8烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流动相（流动相极性大于固定相）。动相（流动相极性大于固定相）。蛋白质分子中既有亲水性基团（蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH等），也有疏水性基团（如苯环、等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和和-CH等）。等）。在水溶液中，疏水性基团避开水而亲合其他疏水性基团，在水溶液中，疏水性基团避开水而亲合其他疏水性基团，即溶质分子的非极性部分在水中倾向于与水的接触面减小即溶质

13、分子的非极性部分在水中倾向于与水的接触面减小，促进了其与填料（疏水性配基）的亲合。，促进了其与填料（疏水性配基）的亲合。不同的蛋白质在相同流动相中由于疏水基团数量、种类以不同的蛋白质在相同流动相中由于疏水基团数量、种类以及表面分布情况不同，与填料的亲合力也不同，从而得到及表面分布情况不同，与填料的亲合力也不同，从而得到分离。分离。结果：结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性小的蛋白质就疏水性小的蛋白质就容容易被洗脱易被洗脱。固定相：固定相：常用常用C4 C8链烃作为配基（键合在固体基质上）为链烃作为配基（键合在固体基质上）为填料。孔径填料。孔径2550

14、 nm。流动相：流动相：水溶性有机溶剂（水溶性有机溶剂（B液）液）（甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃）（甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃）水（水（A液）液）强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸）洗脱能力增大加酸作用：加酸作用：SiOH=SiO-H+蛋白质易与蛋白质易与SiO-结合很难洗脱，加酸抑制上述平衡向右离解。结合很难洗脱，加酸抑制上述平衡向右离解。减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。温度温度：常温：常温 检测检测：用紫外检测器，检测波长：用紫外检测器，检测波长280nm 和和220nm。u280nm检测中含有含苯环的酪氨酸、色氨

15、酸和苯丙氨酸的检测中含有含苯环的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的蛋白质，一般蛋白质都含有苯环，所以蛋白质，一般蛋白质都含有苯环，所以280nm检测是普遍检测是普遍使用的波长。使用的波长。u 220nm主要检测肽键；所以所有蛋白质普遍适用。主要检测肽键；所以所有蛋白质普遍适用。洗脱方式：洗脱方式：梯度洗脱梯度洗脱逐渐增加洗脱强度。逐渐增加洗脱强度。p 蛋白质的分离一般就需要用梯度洗脱，否则有些蛋白质已蛋白质的分离一般就需要用梯度洗脱，否则有些蛋白质已达到突跃会很快被洗脱下来，有些蛋白质还远离突跃区，达到突跃会很快被洗脱下来，有些蛋白质还远离突跃区，实际上无法被洗脱。实际上无法被洗脱。p而有机小分子的反

16、相色谱中未发现此种突跃现象。实际工而有机小分子的反相色谱中未发现此种突跃现象。实际工作中梯度洗脱时间约为作中梯度洗脱时间约为2060min，B液的变化速度约为每液的变化速度约为每分钟分钟5%15%。30m15m5mInfluence of Particle Size on the Separation effect最大优点：分离度最高；最大优点：分离度最高；最大缺点：容易使蛋白质变性失活。最大缺点：容易使蛋白质变性失活。例子：人的胶原蛋白例子：人的胶原蛋白I型型1和和2键的色谱分离键的色谱分离 3.3.2 概念：概念：用适度疏水性的配基作固定相，以盐水体用适度疏水性的配基作固定相，以盐水体 系作流动相，用疏水作用来分离生物大分子化系作流动相，用疏水作用来分离生物大分子化合物的液相色谱法，叫合物的液相色谱法，叫疏水相互作用色谱疏水相互作用色谱(Hyd rophobic Interaction Chromatography,HIC)或或疏水作用色谱。疏水作用色谱。p 在在HIC中：固定相表面有疏水性基团，（如中：固定相表面有疏水性基团，（如-CH2，-CH3，-ph等）。等）。p 蛋白质分