流式细胞术.ppt.ppt

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1、流式细胞术与流式细胞仪流式细胞术与流式细胞仪 1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞流式细胞术发展史流式细胞术发展史目前国内主要流式细胞仪厂家：lBeckton Dickinson(BD)公司lBACKMAN COULTER公司流式细胞仪（flow cytometry，FCM）是一项集激光技术

2、、电子物理技术、光是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。型高科技仪器。流式技术就是对于处在快速直线流动状流式技术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选技术。快速的定量分析和分选技术。一 流式细胞仪分析原理分析原理分析原理 在流动室，鞘液在气泵压力的推动下快速流动。在流动室，鞘液在气泵压力的推动下快速流动。经荧光素标记的特异性抗体染色的单细胞悬液加经荧光素标记的特异性抗体染色的

3、单细胞悬液加入样品管中，在鞘液的约束下分成轴流层和层流入样品管中，在鞘液的约束下分成轴流层和层流层。层。样品和鞘液存有气压差，使细胞成单排列，自喷样品和鞘液存有气压差，使细胞成单排列，自喷嘴喷出，与水平方向的检测激光垂直交叉。细胞嘴喷出，与水平方向的检测激光垂直交叉。细胞表面或内部标记的荧光素受激光照射后发出荧光，表面或内部标记的荧光素受激光照射后发出荧光，同时激光照射细胞产生散射光。同时激光照射细胞产生散射光。这些荧光信号和散射光信号经荧光光电倍增管接这些荧光信号和散射光信号经荧光光电倍增管接受积分并放大，转换为电子信号输入计算机，计受积分并放大，转换为电子信号输入计算机，计算机将所测数据快

4、速而精确的计算出来，并以图算机将所测数据快速而精确的计算出来，并以图表的形式直观的显示出来。表的形式直观的显示出来。散射光信号FSCFSC：细胞的大小。细胞的大小。SSCSSC：反映细胞质内颗粒。反映细胞质内颗粒。分选原理：根据仪器检测到的散射光信号和荧光信号，确根据仪器检测到的散射光信号和荧光信号，确定某一群体为特定的生物学细胞群体，认为的定某一群体为特定的生物学细胞群体，认为的给该群细胞群加上电脉冲信号，使包裹细胞四给该群细胞群加上电脉冲信号，使包裹细胞四周的水滴带上电荷。周的水滴带上电荷。在流经偏转电场时，细胞根据自身带电荷的性在流经偏转电场时，细胞根据自身带电荷的性质产生偏转，落入各自

5、的收容器中，不带电荷质产生偏转，落入各自的收容器中，不带电荷落入废液容器内，从而实现了细胞分选。落入废液容器内，从而实现了细胞分选。美国美国BDBD公司生产的公司生产的FACSCaliburFACSCalibur产品台式分选产品台式分选速度速度300/300/秒，大型机分选速度可高达秒，大型机分选速度可高达10000/10000/秒秒 二 分选原理分类台式机（临床）台式机（临床）大型机（科研）大型机（科研）流式细胞仪结构液流系统液流系统光学系统光学系统分选系统分选系统电子系统电子系统流动室与液流驱动系统流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单

6、个细胞通过。流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。流动室与液流驱动系统激光光源及光束成形系统目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚焦，形成约2266m的光斑，这样激光能量较强，以激发荧光染料。台式机的整个光路是封闭的，在安装时由工程师调试完毕后，无需用户作任何调节，使用十分方便。激光光源及光束成形系统光学系统FCM的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。主要光学原件：

7、滤光片(Filter)l长通滤片 Long Pass Filter,LPl短通滤片 Short Pass Filter,SPl带通滤片 Band Pass Filter,BP信号检测与分析当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射时，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。以激发光光源波长488nm为例示意图：荧光信号示意图散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。l前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。l侧

8、向散射角(Side Scatter，SSC)：与激光束正交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。散射光信号波长与激光相同。散射光信号散射光信号示意图Right Angle Light Detectora a Cell ComplexityForward Light Detector a a Cell Surface AreaIncident Light Source荧光信号一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称自发荧光。一种是经过特异荧光素标记后，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量就能了解所研究细胞参数的存在与定量。常用荧光染料目前台式机FCM配置l

9、488nm激光管常用染料有lPI (Propidium Iodide)lPE (Phycorey-thrin)lFITC (Fluorescein Isothiocyanate)lPerCP (Peridinin Chlorophyll Protein)lPE-CY5等l633nm激光管常用染料有lAPClAPC-Cy主要性能指标荧光检测灵敏度：荧光检测灵敏度：分辩率：分辩率：前向角散射光检测灵敏度：前向角散射光检测灵敏度：分析速度：分析速度：分选指标：分选指标：三三 流式细胞仪的技术要点流式细胞仪的技术要点（一）FCM单细胞标本的制备1、样品来源：周围血、骨髓、淋巴样、样品来源：周围血、骨髓

10、、淋巴样 组织、脑脊液等。组织、脑脊液等。2、抗凝剂的选择；常用的是、抗凝剂的选择；常用的是EDTA和肝和肝素素lEDTA的优点是防止成熟的髓系细胞贴壁的优点是防止成熟的髓系细胞贴壁造成细胞的损失，并具有较强的抗血小板造成细胞的损失，并具有较强的抗血小板集聚能力。集聚能力。l缺点；细胞散射光特征丢失较肝素标本快。缺点；细胞散射光特征丢失较肝素标本快。（一）FCMFCM单细胞标本的制备单细胞标本的制备 3、样品的保存；、样品的保存；l样品中细胞活性与抗凝剂的选择、运输、保样品中细胞活性与抗凝剂的选择、运输、保存和温度密切相关。存和温度密切相关。l一般室温保存即可，要求采集后立刻处理染一般室温保存

11、即可，要求采集后立刻处理染色；色；l肝素抗凝血、髓在室温保存、髓在室温保存48-72小时；小时；lEDTA抗凝血、髓保存抗凝血、髓保存12-24小时，小时，l胞内染色样品可固定细胞长期保存。胞内染色样品可固定细胞长期保存。（一）FCMFCM单细胞标本的制备单细胞标本的制备 4、单细胞悬液制备及荧光染色：、单细胞悬液制备及荧光染色：（以外周血（以外周血作作B27为例）为例）l将单克隆抗体与外周血共孵育，将单克隆抗体与外周血共孵育，裂解红细胞，洗涤裂解红细胞，洗涤固定后，上机待检。固定后，上机待检。l取取EDTA抗凝均匀无凝块血液抗凝均匀无凝块血液50ul l20ul抗体混匀避光抗体混匀避光15-

12、20分钟分钟l1：10溶血素溶血素2ml混匀避光混匀避光102分钟分钟l300g离心离心5分钟弃上清液分钟弃上清液l沉渣加沉渣加5%PBS2ml300g离心离心5分钟弃上清液分钟弃上清液l沉渣加沉渣加0.5-1ml5%PBS混匀待机。混匀待机。注意事项：抗凝血不能有凝块以免影响结果。抗凝血不能有凝块以免影响结果。组织制备单个细胞必须进行机械分离后组织制备单个细胞必须进行机械分离后用蛋白水解酶消化。用蛋白水解酶消化。采用方法裂解红细胞（用于临床）和细采用方法裂解红细胞（用于临床）和细胞梯度密度离心分离法（用于科研）。胞梯度密度离心分离法（用于科研）。（二）FCM常见荧光染料的种类和特性异硫氰酸荧

13、光素（异硫氰酸荧光素（FITC）藻红蛋白（藻红蛋白（FE）多甲藻叶绿素（多甲藻叶绿素（PerCP）异藻蓝蛋白等（异藻蓝蛋白等（APC）151 页表格页表格 4 4流式细胞仪数据的流式细胞仪数据的获取和分析获取和分析 流式细胞仪首先把收集的各种光信号转换成电流式细胞仪首先把收集的各种光信号转换成电压脉冲，然后通过模数转换器转换成为数字号压脉冲，然后通过模数转换器转换成为数字号码，最后以图像形式表示。码，最后以图像形式表示。數据以數据以FSC标准格式储存。有三类：标准格式储存。有三类：l样本获取文件样本获取文件l數据设置文件數据设置文件l數据分析结果。如果是一个數据分析结果。如果是一个4参数（参数

14、（FSC、SSC、FL1、FL2）的单细胞分析会生成的单细胞分析会生成8位数据。位数据。（一）参数目前最先进流式细胞仪已达到三种激发目前最先进流式细胞仪已达到三种激发波长的激光管；波长的激光管；488nm、633nm。407nm。可多达可多达15色分析，加上前向和垂直散射色分析，加上前向和垂直散射光可分析光可分析17个参数。个参数。收集率可达收集率可达70 000细胞，细胞，分析速率达每秒分析速率达每秒50 000细胞，细胞，分辨率达分辨率达262 144道，道，分选精度达分选精度达1/32液滴。液滴。1、单参数图 2 2、双参数图、双参数图 五五 FCMFCM定量分析的质量控制定量分析的质量

15、控制流式细胞仪并非完全自动化，准确的实流式细胞仪并非完全自动化，准确的实验结果还需人工技术配合，所以标本制验结果还需人工技术配合，所以标本制备要规范，仪器本身需要质量控制。备要规范，仪器本身需要质量控制。（一）荧光染色过程中的质量控制（一）荧光染色过程中的质量控制1.细胞浓度细胞浓度 不低于不低于1106/ml。2.封闭剂封闭剂 l0.5%小牛血清清蛋白、小牛血清清蛋白、1%小牛血清或幼小牛血清或幼年家兔血清作封闭剂，血清要灭活预实验排年家兔血清作封闭剂，血清要灭活预实验排除细胞毒性。除细胞毒性。l作用是封闭细胞表面作用是封闭细胞表面IgFc受体，防止非特受体，防止非特异性与荧光素标记抗体结合

16、而被染上荧光。异性与荧光素标记抗体结合而被染上荧光。（一）荧光染色过程中的质量控制（一）荧光染色过程中的质量控制 3.洗涤：洗涤：l常用常用FBS做洗涤液，内加一定浓度的做洗涤液，内加一定浓度的5%-10%小牛血清除了封闭非特异性结合外，还小牛血清除了封闭非特异性结合外，还有助于保持细胞活性。有助于保持细胞活性。l0.2%的的NaN3防止抗原抗体反应后发生联合防止抗原抗体反应后发生联合解离。解离。l染色后充分洗涤防止假阳性和假阴性。染色后充分洗涤防止假阳性和假阴性。l防止混合剧烈以免破碎细胞过多，导致非特防止混合剧烈以免破碎细胞过多，导致非特异性荧光。异性荧光。l注意离心速度，减少细胞粘连。注意离心速度，减少细胞粘连。（一）荧光染色过程中的质量控制（一）荧光染色过程中的质量控制4、过滤：、过滤：用用400目滤网过滤，去除粘连目滤网过滤，去除粘连细胞团。细胞团。5、对照：、对照：空白对照、阴性对照、单染空白对照、阴性对照、单染荧光抗体对照。荧光抗体对照。6、温度：、温度：冰上或冰上或4进行。进行。7、结果判断：、结果判断：减去本底荧光。减去本底荧光。8、避光：保证细胞免疫荧光的稳定性。、