PCR的临床应用知识.ppt

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1、基本原理基本原理n以以DNA为例为例n（1）DNA变性变性：n（2）降温退火：）降温退火：n（3）引物延伸）引物延伸：1 12 23 34 45 52222555572729494时间（时间（minmin）温度温度（）PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点适温延伸适温延伸3 3高温变性高温变性1 1低温退火低温退火2 2重复重复1313步步25302530轮轮目的目的DNADNA片段片段扩增扩增100100万倍以上万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性DNADNA变性变性形成形成2 2条单链条单

2、链子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍原理原理 第一步第一步 加热变性加热变性n预处理第二步第二步 引物与靶序列退火引物与靶序列退火第三步第三步-引物延伸引物延伸第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 得到两个拷贝的靶序列得到两个拷贝的靶序列3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.Amplicon Cycles Copies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,82430次循环扩增后可达次循环扩增后可达10亿的基因片段亿的基因片段PCRPCR技术的特点技术的特点 灵敏灵敏度高度高 特异特异性

3、强性强 快速快速简便简便 应用应用范围广范围广临床应用n肝炎病毒(HBV、HCV)n优生优育优生优育(HCMVHCMV、TOXTOX、RVRV、HSVIHSVI、HSVIIHSVII)n性病病原体性病病原体(CT、UU、NGH、HPV、TP)n呼吸道病原体呼吸道病原体(TB、MP、CP、SARS、H1N1)n其他病原体其他病原体(EB、HP、EV71、EV、Cox A16)肝炎病原体检测的意义肝炎病原体检测的意义nHBV、HCV1、了解肝炎病毒在体内存在的了解肝炎病毒在体内存在的数量数量。传染？传染？复制？复制？治疗？治疗？2、肝功能异常是否由肝炎病毒引起？早、肝功能异常是否由肝炎病毒引起？早

4、 期诊断期诊断（窗口期窗口期）的感染者。）的感染者。3、基因分型可选、基因分型可选抗病毒药物抗病毒药物。（选用分型试剂）。（选用分型试剂）4、判断药物治疗的、判断药物治疗的效果效果。5、进行、进行HBV分子流行病学研究。分子流行病学研究。乙肝DNA与肝功的关系n1.乙肝DNA报告单所描述的结果是代表在送检的样本中检测到乙肝病毒的遗传物质（DNA）。n2.乙肝DNA阳性与阴性与肝功能没有直接关系。n3.用辩证的思维理解每一份检测结果。不合格标本带来的后果不合格标本带来的后果标本不合格标本不合格结果不准确结果不准确诊断错误诊断错误治疗错误治疗错误70%耽误治疗耽误治疗PCR结果单位的换算3.5E+

5、005 IU/ml(3.5105基因基因/拷贝拷贝)-表表示一毫升血清中有示一毫升血清中有35万个万个HBV病毒微粒。病毒微粒。HBVDNA的变化的变化在患者治疗过程中检测在患者治疗过程中检测HBVDNA定量，定量，一般认为：其结果相差一般认为：其结果相差5倍属正常波动，倍属正常波动，结果相差降低结果相差降低10倍以上才算治疗有效。倍以上才算治疗有效。例如例如1n有一患者治疗前检测有一患者治疗前检测HBV-DNA定量为定量为8.8E+006 IU/ml，治疗一月后复查为，治疗一月后复查为2.3E+007 IU/ml，两结果相差，两结果相差2.6倍。倍。（不一定是高了？）（不一定是高了？）如何向

6、病人解释：如何向病人解释：属正常波动或者检测误差属正常波动或者检测误差（允许误差）（允许误差）例如例如2一患者治疗前检测一患者治疗前检测HBV-DNA定量为定量为9.2E+006 IU/ml；治疗一月后复查为；治疗一月后复查为2.8E+006 IU/ml，两结果相差，两结果相差3.3倍，不倍，不能说明治疗有效，需要继续观察。要有能说明治疗有效，需要继续观察。要有明显的下降明显的下降趋势趋势。PCR技术的新认识技术的新认识n PCR 技术诞生以来，应用广泛，同时技术诞生以来，应用广泛，同时不断发展与完善，不断发展与完善，解决了解决了以往以往PCR 的的瓶瓶颈问题：灵敏度、假阳性颈问题：灵敏度、假阳性。n 防污染问题：假阳性防污染问题：假阳性的解决。它将作为的解决。它将作为常规检验方法进行全面普及，发挥积极常规检验方法进行全面普及，发挥积极的作用。的作用。临床基因扩增实验室平面图标本接收区试剂准备区核酸提取区核酸扩增区产物分析区专用通道缓冲区缓冲区