实时荧光定量PCR技术.ppt

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1、2023-12-6 12023-12-6 2主要内容主要内容第一节第一节 聚合酶链反应聚合酶链反应 第二节第二节 其他其他PCRPCR相关技术相关技术第三节第三节 实时实时/荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术第四节第四节 PCRPCR产物分析产物分析2023-12-6 3n 标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系总体积 X XA A 0.11ugB B 各0.10.2umol/LC C 2.5u D D 各200umol/LE E 含含 缓冲液缓冲液 1.5 mmol/L PCR PCR扩增反应体系配制扩增反应体系配制2023-12-6 4lPCR的程序编排与解读 123452255729

2、4时间（min）温度（）D3B1C2重复 X 步Y 轮目的DNA片段扩增 Z Z 倍以上A2023-12-6 5第三节第三节 实时实时/荧光定量荧光定量PCR 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧，利用荧光信号累积光信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 Real-time/Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction 2023-12-6 6n常规常规PCRPCR技术：技术：对对PCRPCR扩增反应的扩增

3、反应的终点产物终点产物进行定量和定性分进行定量和定性分析。析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时检测（开盖检测（开盖检测“气溶胶气溶胶”污染污染问题）。问题）。n实时实时/荧光定量荧光定量PCRPCR技术：技术：利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循环每一个循环扩增产物量的变化，通过扩增产物量的变化，通过CtCt值值和标准和标准曲线的分析对曲线的分析对起始模板起始模板进行进行定量分析定量分析 实时实时/荧光定量荧光定量PCR的优势的优势2023-12-6 7由于各反应管内由于各反应管内P

4、CRPCR扩增效率的差异使扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大差异得相同的样品扩增结果存在很大差异同时扩增同时扩增96份相同样品的份相同样品的Ct值一样，最终产物量却差异巨大值一样，最终产物量却差异巨大n终点检测法终点检测法定量的缺点定量的缺点2023-12-6 8n荧光定量荧光定量PCR实时检测实时检测的优点的优点终产物终产物量一样量一样起始量起始量不同不同2023-12-6 9n普通和实时定量普通和实时定量PCR的综合比较表的综合比较表项项 目目普通普通PCR实时定量实时定量PCR检测方法检测方法终点检测终点检测实时检测实时检测准确性准确性差差 好好重复性重复性差差 好好安全性安全

5、性低低 高高通通 量量低低 高高价价 格格便宜便宜昂贵昂贵2023-12-6 10n 荧光荧光染料法染料法 SYBR greenSYBR green:特异性结合双链，释放荧光信号n 荧光荧光探针法探针法 1.Taqman1.Taqman技术技术 2.molecular Beacon2.molecular Beacon技术技术 3.3.复合探针法复合探针法 一、荧光定量荧光定量PCRPCR荧光标记物荧光标记物 2023-12-6 11（一）荧光染料法 SYBRSYBR荧光染料荧光染料SYBRSYBR荧光染料能特异性地掺荧光染料能特异性地掺入入DNADNA双链，发出荧光信号，而双链，发出荧光信号，

6、而不掺入链中的不掺入链中的SYBRSYBR染料分子不会发出任何荧光信号染料分子不会发出任何荧光信号，从而保，从而保证荧光信号的增加与证荧光信号的增加与PCRPCR产物的增加完全同步。产物的增加完全同步。此方法未使用目的特异性探针，其此方法未使用目的特异性探针，其特异性完特异性完全由引物决定全由引物决定。在有非特异双链。在有非特异双链DNADNA产生时，产生时，其荧光也同样增强，此法与常规其荧光也同样增强，此法与常规PCRPCR的特异性的特异性差别不大。差别不大。2023-12-6 12q SYBR Green SYBR Green 能结合到双链能结合到双链DNADNA的的小沟小沟部位部位q S

7、YBR Green SYBR Green 只有和双链只有和双链DNADNA结合后才发荧光结合后才发荧光q 变性时，变性时，DNADNA双链分开，无荧光双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链复性和延伸时，形成双链DNADNA，SYBR Green SYBR Green 发荧光，发荧光，在此阶段采集荧光信号。在此阶段采集荧光信号。SYBR SYBR Green Green 2023-12-6 13 原理：未结合DNA的SYBR染料不发荧光，但只要掺入DNA双链，SYBR荧光染料能发射荧光，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。uSYBR荧光染料法 2023-12-6 14nSYBR G

8、reen 法优缺点 q 对对DNADNA模板没有选择性模板没有选择性 -适用于任何适用于任何DNADNAq 使用方便使用方便 -不必设计复杂探针不必设计复杂探针q 非常灵敏非常灵敏q 便宜便宜优 点q 容易与非特异性双链容易与非特异性双链DNADNA结合，产生假阳性结合，产生假阳性,但可以通但可以通过过融解曲线的分析融解曲线的分析，优化反，优化反应条件应条件q 对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高缺缺 点点2023-12-6 15（二）荧光探针法与目标序列互补v 5 5端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter,R)(Reporter,R)，如，如FAMFAM、VICVIC等等 v

9、 33端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 (Quencher,Q)(Quencher,Q)v 探针完整，探针完整，R R所发射的荧光能量被所发射的荧光能量被Q Q基团吸收基团吸收 ，“不发不发”荧光，荧光，R R与与Q Q分开，发荧光分开，发荧光v TaqTaq酶有酶有 5353外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，延伸时延伸时水解探针水解探针1 1水解探针技术（水解探针技术（TaqmanTaqman技术）技术）2023-12-6 163端的荧光Q分子吸收5端荧光R分子的荧光信号 探针5端连接的荧光R分子被Taq酶切割下来 荧光R分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR数量成比例 5353QRQ

10、53R53激发激发5353激发激发RQ引物Taq 酶2023-12-6 172023-12-6 18 TaqmanTaqman探针探针+UNG+UNG酶技术动画酶技术动画2023-12-6 19nTaqManTaqMan法优缺点法优缺点q 对目标序列的高特异性对目标序列的高特异性 -阴性结果确定阴性结果确定q 设计相对简单设计相对简单 -与目标序列某一区与目标序列某一区域互补域互补q重复性比较好重复性比较好优优 点点q 只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标q 委托公司标记，价格较高委托公司标记，价格较高q 不易找到不易找到本底本底低的探针低的探针缺缺 点点2023-12-6 20n Taq

11、man技术的延伸：TaqMan-MGB探针 针对针对TaqmanTaqman探针荧光淬灭不彻底的问题，探针荧光淬灭不彻底的问题，MGBMGB探针，探针，3 3端采用了端采用了非荧光性的淬灭基因非荧光性的淬灭基因淬灭基团吸收报告淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。2023-12-6 21MGB:Minor Groove Binder(Tm enhancer)MGBNFQRn此外，此外，MGBMGB探针的探针的3 3端还连接了一个端还连接了一个三肽三肽，可以大，可以大大稳定探针与模板的杂交大稳定探针与模板的杂交,升高探针升

12、高探针Tm Tm 值值,使较使较短的探针同样能达到较高的短的探针同样能达到较高的Tm Tm 值值而而短探针短探针的的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近荧光报告基团和淬灭基团的距离更近,淬灭效果更淬灭效果更好，荧光背景更低，信噪比更高。好，荧光背景更低，信噪比更高。2023-12-6 22 将荧光供体分子和受体分子分别标记在两个将荧光供体分子和受体分子分别标记在两个不同的探针上，产生荧光供体探针和受体探针。不同的探针上，产生荧光供体探针和受体探针。与靶序列退火时，退火时，两探针的荧光供体和受体分子紧密相邻，发生FRET产生荧光。荧光强度与起始模板的量成正比，以此可进行PCR定量分析。2.2.杂交探

13、针技术杂交探针技术 荧光的程度与起始模板数的量成正比 ABB 荧光受体 A 荧光供体2023-12-6 233 3Molecular beaconMolecular beacon技术技术(分子信标法分子信标法)RQ激发激发RQQR激发激发发射发射分子灯塔形成茎环发夹结构,使荧光剂和淬灭剂紧密接触,导致荧光淬灭 单链寡核苷酸探针由于与靶基因碱基序列互补而与之杂交探针5和3端分离,淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消失,产生荧光 工作原理工作原理发夹形的寡聚核苷酸探针 内部淬灭荧光团2023-12-6 244 4复合探针法（复合探针法（complex probescomplex probes）该法的基本原理

14、是首先合成两个探针，一是荧光探针（25bp），5端接一荧光分子，另一为淬灭探针（15bp），3端接一淬灭分子，淬灭探针能与荧光探针5端杂交。Q淬 灭 Q 淬灭探针 R 发光探针RR2023-12-6 25几种荧光定量PCR标记法的应用比较方法优点缺点适用范围SYBR Green I 染料法染料法适用性广适用性广灵敏灵敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出现非特异性易出现非特异性带带适合科研中对各种目的基适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植的研究，转基因重组动植物的研究物的研究TaqMan探针探针特异性高特异性高重复性好重复性好价格高价格高

15、只适合特定目标只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基病原体检测，疾病耐药基因研究因研究,药物疗效考核药物疗效考核遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断分子信标分子信标高特异性高特异性荧光荧光背景低背景低只适合特定目标只适合特定目标设计困难设计困难价格高价格高特定基因分析特定基因分析SNP分析分析2023-12-6 26 我校配备的实时荧光我校配备的实时荧光PCRPCR仪仪 ABI-Step one 罗氏罗氏 Light Cycler 二、荧光定量PCR设备原理2023-12-6 27ABI 7500荧光定量荧光定量PCR仪仪 MJ公司公司Chromo 4荧光定量荧光定量PCR仪仪 Bio-rad公司公司i

16、Cycler荧光定量荧光定量PCR仪仪 n普通普通实时荧光实时荧光PCR仪仪2023-12-6 28 普通实时荧光PCR仪信号采集示意2023-12-6 29n离心式离心式实时荧光实时荧光PCR仪仪Rotor-Gene 3000荧光定量荧光定量PCR仪仪 Roche Light CycleTM荧光定量荧光定量PCR仪仪 2023-12-6 30 离心式荧光定量PCR仪结构示意2023-12-6 31 温度温度均一性较好均一性较好；使用同一个激发光源和检测器，随时检测使用同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，旋转到跟前的样品，有效减少系统误差有效减少系统误差；可容纳样品量少，需用可容纳样品量少，需用特殊毛细管特殊毛细管，增加，增加使用成本，不带梯度功能。使用成本，不带梯度功能。uRoche离心式实时定量离心式实时定量PCRPCR仪特点仪特点 2023-12-6 32 三、实时荧光PCR结果分析 322023-12-6 33 实时荧光PCR结果分析示例2023-12-6 34定量原理定量原理介绍三个概念：介绍三个概念：扩增曲线扩增曲线、荧光阈值荧光阈值、CtCt值值如何对起始模