免疫胶体金技术.ppt

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1、l免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗 体的一种新型的免疫标记技术。l胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。1939-雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。1971-作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。1974-实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法l快速免疫金渗滤法快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay,IGFA)即穿流式(

2、flow through)的固相膜免疫测定。主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。l免疫层析法免疫层析法(immunochromatography，ICA)是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定，与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层析作用的横流（lateral flow）)向另一端移动。移动过程中被分析物 与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后

3、通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其精密度和准确性均符合定量测定要求。不足：金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开发与应用。H2O,100OCH2AuCl4Cit-Cit-Cit-Cit-Turkevich,et

4、.al.Discussions Faraday Soc.1951,No.11 55-75.OOOOHOOOAdd 100 mL of 1.0%HAuCl4 to a 200 mL Erlenmeyer flask on a stirring hot plate.Add a magnetic stir bar and bring the solution to a boil To the boiling solution,add 1.5 mL of a 1%solution of trisodium citrate dihydrate,Na3C6H5O7.2H2O Stop heating wh

5、en a deep red color is obtained.胶体金粒径(nm)1%柠檬酸三钠加入量(ml)胶体金特性 呈色 max162橙色518nm24.51.5橙色522nm411红色525nm71.50.7紫红535nmGood gold colloids and bad(unstable)gold colloids 劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大 How are the antibodies coupled to the gold?Conjugation of antibodies to gold particles depends upon three

6、 separate but dependent phenomena:na).ionic attraction between the negatively charged gold and the positively charged proteinnb).hydrophobic attraction between the antibody and the gold surfacenc).Sulfur binding(Cysteine and Methionine)Strongest binding suggested to be the sulfur hinge joining the t

7、he two Fc regions胶体金颗粒带电情况 抗体和金颗粒的耦联（图出处：IVD Technology）u样品垫(Sample pad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。样品垫的作用：减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布；去除样品中杂质颗粒；调节样品液pH值或粘度等。样本垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差异，提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使用复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。u结合垫(Conjugate pad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种

8、材质，多种规格，批间稳定。结合垫的作用主要为：-吸附一定量的金标结合物颗粒；-吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上；-保持金标结合物颗粒的稳定性；-保证金标结合物颗粒定量完全释放等。u硝酸纤维素膜(Nitrocellulose)：推荐使用Millipore，MDI，S&S，whatman 等国外公司的硝酸纤维素膜。NC膜的作用：-在检测线和对照线条带区域固定抗体；-样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应；-反应在NC膜上显色，读检测结果 NC膜的重要参数：孔径、对称性、层析速度、表面活性剂、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均一性等。u片材：不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了产品的货架期。u吸收垫(Absorbent Pad)：提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸收纸；吸收纸的作用：主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。胶体金法检测胶体金法检测TB-Ab(双抗原夹心法双抗原夹心法)