第七章放线菌遗传.ppt

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1、第七章：放线菌遗传第七章：放线菌遗传 在放线菌遗传学研究中，以链霉菌属在放线菌遗传学研究中，以链霉菌属(Streptomyces)为主要研究对象。为主要研究对象。链霉菌属是革兰阳性、多细胞、丝状土壤细菌。具有复链霉菌属是革兰阳性、多细胞、丝状土壤细菌。具有复杂的形态分化周期，包括孢子萌发产生分枝状的基质菌丝，杂的形态分化周期，包括孢子萌发产生分枝状的基质菌丝，基质菌丝再发育成气生菌丝和孢子。基质菌丝再发育成气生菌丝和孢子。链霉菌属的最显著特征是产生广泛的、具有重要价值的链霉菌属的最显著特征是产生广泛的、具有重要价值的次级代谢产物：如抗生素、水解酶、酶的抑制剂、免疫调节次级代谢产物：如抗生素、水

2、解酶、酶的抑制剂、免疫调节剂和色素等。剂和色素等。在自然界已发现的近万种抗生素中，约在自然界已发现的近万种抗生素中，约70是由链霉是由链霉菌产生的，如链霉素、红霉素、四环素、利福霉素、多氧霉菌产生的，如链霉素、红霉素、四环素、利福霉素、多氧霉素、阿维菌素、井冈霉素等，这些抗生素已广泛用于医药、素、阿维菌素、井冈霉素等，这些抗生素已广泛用于医药、农业和畜牧业。农业和畜牧业。1955年年塞蒙梯塞蒙梯(Semonti)夫妇首先发现天蓝色链霉菌夫妇首先发现天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)可通过遗传交换产生重组可通过遗传交换产生重组体。体。(Hopwood)也在也在

3、 S.coelor A3(2)菌株中证实了这一重组菌株中证实了这一重组作用。作用。20世纪世纪70年代早期年代早期，所有研究都集中在描述遗传特征和染，所有研究都集中在描述遗传特征和染色体特性上，色体特性上，19731978年研究重点转移到放线菌的性别年研究重点转移到放线菌的性别体系和遗传重组方面。同期，还利用遗传方法对抗生素合成、体系和遗传重组方面。同期，还利用遗传方法对抗生素合成、形态分化、噬菌体等开展了全方位的研究。形态分化、噬菌体等开展了全方位的研究。20世纪世纪80年代年代，将重组，将重组DNA技术和原生质体融合技术应用技术和原生质体融合技术应用在该属的研究中。在该属的研究中。20世纪

4、世纪90年代年代，用分子生物学方法开展了对放线菌的基因，用分子生物学方法开展了对放线菌的基因组、形态分化的分子机制等方面的研究。组、形态分化的分子机制等方面的研究。放线菌遗传的研究历程：放线菌遗传的研究历程：光学显微镜和电镜观察表明，像其他细菌的染色体一样，光学显微镜和电镜观察表明，像其他细菌的染色体一样，天蓝色链霉菌天蓝色链霉菌A3(2)的染色体的染色体 DNA在细胞中以致密的、拟核在细胞中以致密的、拟核状态存在。状态存在。链霉菌的染色体链霉菌的染色体DNA也是形成许多超螺旋区域，并与蛋白也是形成许多超螺旋区域，并与蛋白质和质和RNA分子结合在一起。染色体在菌丝中以多拷贝形式存分子结合在一起

5、。染色体在菌丝中以多拷贝形式存在，而在孢子中以单拷贝形式存在。在，而在孢子中以单拷贝形式存在。第一节第一节 链霉菌的染色体链霉菌的染色体 一、链霉菌的染色体一、链霉菌的染色体DNA 以前，一直认为链霉菌的染色体与大肠杆菌一样是环状染以前，一直认为链霉菌的染色体与大肠杆菌一样是环状染色体。自从色体。自从1993年用脉冲电泳年用脉冲电泳(PFGE)和酶切物理图谱等研和酶切物理图谱等研究方法，首次证明变铅青链霉菌究方法，首次证明变铅青链霉菌(S.1ividans)的染色体是线的染色体是线性而非环状以来，越来越多的研究证据表明：性而非环状以来，越来越多的研究证据表明：几乎所有链霉菌的染色体都为线性而非

6、环状，链霉菌只有几乎所有链霉菌的染色体都为线性而非环状，链霉菌只有一条染色体，基因内部无内含子。一条染色体，基因内部无内含子。染色体大约均为染色体大约均为 8Mb，几乎是大肠杆菌染色体的，几乎是大肠杆菌染色体的2倍，少数倍，少数链霉菌的染色体小于链霉菌的染色体小于8Mb。链霉菌基因组。链霉菌基因组G+C含量为含量为7375，重复，重复DNA序列为序列为4-11。线性染色体具有两个特征：线性染色体具有两个特征：1、染色体的两个末端具有长度为、染色体的两个末端具有长度为24-600kb的反向重复的反向重复序列，简称序列，简称TIR(terminal inverted repeat)。如：天蓝色链霉

7、菌的如：天蓝色链霉菌的TIR为为61kb 变铅青链霉菌的变铅青链霉菌的TIR为为30kb 灰色链霉菌灰色链霉菌(S.grlseus)的的TIR为为24kb2、每个、每个DNA链的链的5末端都有共价结合蛋白，简称末端都有共价结合蛋白，简称 TP(terminal protein)。天蓝色链链菌天蓝色链链菌A3 M145菌株基因组全长菌株基因组全长8,667,507bp，含有含有7825个编码基因，是迄今为止拥有最多基因的细菌。个编码基因，是迄今为止拥有最多基因的细菌。其中调控基因有其中调控基因有965个，占整个基因组的个，占整个基因组的12.3%。编码次级。编码次级代谢产物（包括抗生素）合成酶基

8、因大约占基因组的代谢产物（包括抗生素）合成酶基因大约占基因组的5%，平均每个基因编码区的长度为平均每个基因编码区的长度为1.14kb。天蓝色链霉菌天蓝色链霉菌A3 M145和变青铅链霉菌的染色体中央有复和变青铅链霉菌的染色体中央有复制起点制起点oriC，一般认为链霉菌素线性染色体的复制通过，一般认为链霉菌素线性染色体的复制通过oriC复制原点进行双向复制，末端蛋白作为引物（复制原点进行双向复制，末端蛋白作为引物（TP-primesed）引导染色体末端及冈崎片段的合成。引导染色体末端及冈崎片段的合成。1997年年8月英国开始了对天蓝色链霉菌月英国开始了对天蓝色链霉菌A3(2)M145菌菌株的基因

9、组进行全序列测定，并于株的基因组进行全序列测定，并于2002年全部完成。年全部完成。遗传不稳定性是链链菌的主要特征之一，这与其较大的线遗传不稳定性是链链菌的主要特征之一，这与其较大的线性染色体直接相关。链霉菌线性染色体和质粒具有相似的结性染色体直接相关。链霉菌线性染色体和质粒具有相似的结构，一般分为核心区和两臂区。构，一般分为核心区和两臂区。核心区是遗传相对稳定区域，生命活动的必需基因均位于此。核心区是遗传相对稳定区域，生命活动的必需基因均位于此。两臂区位于染色体的两个线性末端，长度有一定差异，富含两臂区位于染色体的两个线性末端，长度有一定差异，富含小的回文重复序列，小的回文重复序列，5-端与

10、蛋白质共价结合，并受其保护。端与蛋白质共价结合，并受其保护。线性染色体末端容易丢失，有时可达线性染色体末端容易丢失，有时可达2Mb（占整个基因组的（占整个基因组的1/4），失去部分末端序列并不影响链霉菌的生长，但影响次），失去部分末端序列并不影响链霉菌的生长，但影响次生代谢，如气生菌丝及孢子形成、抗生素、色素的生成。生代谢，如气生菌丝及孢子形成、抗生素、色素的生成。链霉菌的染色体具有高度的遗传不稳定性，常发生缺失和链霉菌的染色体具有高度的遗传不稳定性，常发生缺失和扩增，引起染色体重排。染色体缺失的范围可高达扩增，引起染色体重排。染色体缺失的范围可高达2000kb以上。染色体扩增是指某些染色体以

11、上。染色体扩增是指某些染色体DNA序列的拷贝数专一地序列的拷贝数专一地大量增加的现象。在描述染色体扩增时常用到大量增加的现象。在描述染色体扩增时常用到AUD和和ADS术术语：语：AUD(amplified unit of DNA)是指扩增单位，来定义是指扩增单位，来定义DNA扩增的区域，扩增的区域，AUD的长度为的长度为525kb，两侧是，两侧是12kb的重的重复序列。复序列。ADS(amplified DNA sequence)是用来定义扩增的是用来定义扩增的 DNA序序列，是扩增单位通过串联重复而形成。列，是扩增单位通过串联重复而形成。二、链霉菌染色体的缺失、扩增和重排二、链霉菌染色体的缺

12、失、扩增和重排 在基因扩增的突变体中，扩增的在基因扩增的突变体中，扩增的DNA序列序列(ADS)很容易很容易检测，因为在染色体酶切电泳图谱中，检测，因为在染色体酶切电泳图谱中，ADS呈很强的带型。呈很强的带型。在有些突变体中，在有些突变体中，ADS是染色体的重要组成成分，含量可高是染色体的重要组成成分，含量可高达染色体达染色体DNA的的30。链霉菌染色体的缺失和扩增引起的自发突变可高达链霉菌染色体的缺失和扩增引起的自发突变可高达0.1一一1，用，用UV照射或生长过程中加入溴化乙锭后，突变率可照射或生长过程中加入溴化乙锭后，突变率可达达10甚至更高。甚至更高。在变铅青链霉菌在变铅青链霉菌66和天

13、蓝色链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)中，最常发生缺失中，最常发生缺失的染色体片段是位于染色体末端的氯霉素抗性基因。末端的氯的染色体片段是位于染色体末端的氯霉素抗性基因。末端的氯霉素抗性基因缺失后，缺失末端重组而环化形成环状染色体，霉素抗性基因缺失后，缺失末端重组而环化形成环状染色体，因此许多氯霉素敏感突变株具有环状的染色体末端。因此许多氯霉素敏感突变株具有环状的染色体末端。在变铅青链霉菌中，约有在变铅青链霉菌中，约有0.5的氯霉素敏感突变株的氯霉素敏感突变株Cmls，这种突变株表现更不稳定，约以这种突变株表现更不稳定，约以25的频率突变为精氨酸缺陷的频率突变为精氨酸缺陷型型(Arg-)，这种缺陷

14、型是由于编码精氨酰琥珀酸合成酶，这种缺陷型是由于编码精氨酰琥珀酸合成酶argG(argininosuecinate synthetase)的基因缺失造成的。的基因缺失造成的。1.变铅青链霉菌的氯霉素和精氨酸变铅青链霉菌的氯霉素和精氨酸(CmlsArg-)双突变株双突变株Cmls Arg-双突变株携带着双突变株携带着AUD1。AUD1是由是由1kb-4.7kb-4.7kb-1kb组成。组成。AUD1位于位于距离线性染色体的末端约距离线性染色体的末端约800kb。在在Cmls Arg-双突变株中，与双突变株中，与 AUD1一起被扩增的还有一起被扩增的还有AUD2，AUD2距离染色体末端约距离染色体

15、末端约300kb。AUD2携带携带编码汞离子抗性的基因，大小为编码汞离子抗性的基因，大小为70kb。灰色链霉菌灰色链霉菌2247的染色体是的染色体是7.8Mb的线性染色体。的线性染色体。A因子因子(A factor)是一种细菌激素，对链霉素是一种细菌激素，对链霉素(Strepotmycin)的产生和的产生和孢子形成起着正调节作用，孢子形成起着正调节作用，afsA基因产物是基因产物是A因子生物合成的因子生物合成的一个关键酶。一个关键酶。afsA基因距离染色体左末端基因距离染色体左末端150kb。afsA基因基因在高温条件下培养或用在高温条件下培养或用UV照射后，以高频率丢失。照射后，以高频率丢失

16、。通过亚硝基胍通过亚硝基胍(NTG)和高温诱变获得了和高温诱变获得了2个个afsA-突变株，对突变株，对这这2个突变株进行分子生物学鉴定，发现突变株的染色体个突变株进行分子生物学鉴定，发现突变株的染色体(包括包括afsA位点位点)发生了缺失：发生了缺失：A突变株的染色体左末端突变株的染色体左末端180kb和右末端和右末端20kb缺失缺失 B突变株的染色体左末端突变株的染色体左末端350kb和右末端和右末端130kb缺失缺失 2.灰色链霉菌染色体缺失使灰色链霉菌染色体缺失使afsA位点丢失位点丢失 这这2个突变株的缺失染色体都再环化形成环状染色体。个突变株的缺失染色体都再环化形成环状染色体。对环状染色体的接头对环状染色体的接头(junction)进行克隆和序列分析，并进行克隆和序列分析，并与亲本菌株进行比较。与亲本菌株进行比较。发现接头处并无大范围的同源区，而只有发现接头处并无大范围的同源区，而只有6bp的小同源的小同源区，说明染色体的环化是由于非同源重组引起的，属于异区，说明染色体的环化是由于非同源重组引起的，属于异常重组。环状染色体在这两个突变株中都能稳定存在。常重组。环状染色体在这