第2章分子克隆工具酶.ppt

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1、第二章第二章 分子克隆工具酶分子克隆工具酶 第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶第二节第二节 甲基化酶甲基化酶第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶第四节第四节 其他分子克隆工具酶其他分子克隆工具酶 在过去20多年里，生物科学取得的许多革命性进步都直接来源于对基因的进一步认识和操作。基因操作或遗传工程的主要工具就是那些可在DNA分子上催化特异性反应的酶。酶的切割位点可作为DNA物理图的特殊标记，利用限制性内切酶可产生特定大小的DNA片段并使纯化这些DNA片段成为可能，获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质。对DNA进行修饰的工具的出现，为重组DNA的实现创造了条件。第一节第一节 限制性

2、内切酶限制性内切酶一、限制与修饰一、限制与修饰1、限制与修饰现象：、限制与修饰现象：限制限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶限制性内切酶（restriction ednonuclease）的作用，破坏入侵的噬菌体的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主范围受到限制。，导致噬菌体的寄主范围受到限制。限制作用实际就是限制性内切酶限制作用实际就是限制性内切酶降解外源降解外源DNA，维护宿主遗，维护宿主遗传稳定的保护机制。传稳定的保护机制。修饰修饰(modification)：指寄主本身的指寄主本身的DNA，由于在合成后通过，由于在合成后

3、通过甲基化酶（甲基化酶（methylase）的作用得以甲基化，使的作用得以甲基化，使DNA得以修得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用宿主细胞通过甲基化作用达到修饰作用宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外识别自身遗传物质和外来遗传物质来遗传物质的目的。的目的。甲基化作用：最主要的碱基修饰，使腺嘌呤甲基化作用：最主要的碱基修饰，使腺嘌呤A成为成为N6-甲基腺嘌甲基腺嘌呤，胞嘧啶成为呤，胞嘧啶成为5-甲基胞嘧啶。甲基胞嘧啶。2.2.限制酶的发现限制酶的发现起始于起始于2020世纪世纪6060年代对细菌的研究。年代对细菌的研究。至至2006年年2月，

4、共发现月，共发现3773种限制性内切酶，种限制性内切酶，I、II、III型各型各有有68、3692、10种，甲基化指导的种，甲基化指导的3种，商品化的种，商品化的609种，种，II型中共有型中共有223种特异性。种特异性。限制酶是一类能够识别双链限制酶是一类能够识别双链DNADNA分子中的某种特定核苷酸序列，分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割并由此切割DNADNA双链结构的核酸水解酶。双链结构的核酸水解酶。限制酶存在于细菌中，也存在于一些病毒中，真核生物中没有限制酶。碱基对（base pair,bp）限制性核酸内切酶的命名原则限制性核酸内切酶的命名原则19731973年年H.O.Smith

5、H.O.Smith和和D.NathamsD.Nathams首次提出命名原首次提出命名原则，则，19801980年年RobertsRoberts在此基础上进行了系统分类在此基础上进行了系统分类限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名表该酶的宿主菌属名(genus);第二、三个字母第二、三个字母(小小写，斜体写，斜体)代表宿主菌种名代表宿主菌种名(species)。第四个字母代表宿主菌的株或型第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)，正体，正体。若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根

6、据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示，正体写在第正体写在第4个字母之后，字母间无间隔个字母之后，字母间无间隔。例：例：EcoEcoR R、Hind、Sal限制性核酸内切酶的命名原则：限制性核酸内切酶的命名原则：属名属名 种名种名 株名株名Haemophilus influenzae strain d 流感嗜血杆流感嗜血杆菌菌d株株 Hind Hind同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶3.3.限制性核酸内切酶的种类限制性核酸内切酶的种类据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有据限制性核酸内切酶

7、的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为修饰酶活性，可分为、型三大类。型三大类。型限制酶用途大，多为同源二聚体，其中切口酶只在单链型限制酶用途大，多为同源二聚体，其中切口酶只在单链上产生切口，上产生切口，ss型识别序列和切割位置特殊。型识别序列和切割位置特殊。主要特性主要特性型型型型型型酶分子酶分子识别位点识别位点切割位点切割位点限制与甲基限制与甲基化化辅因子辅因子多寡，用途多寡，用途内切酶与甲基化酶不内切酶与甲基化酶不在一起在一起4-6bp，多为回文序列，多为回文序列识别序列内或附近特识别序列内或附近特异切割异切割分开的反应分开的反应Mg2+种类多，用途大种类多，用途大三亚基双功

8、能酶三亚基双功能酶二分非对称二分非对称无特异性，距识别无特异性，距识别序列序列1kb处外处外互斥互斥ATP Mg2+SAM种类少，用途小种类少，用途小二亚基双功能酶二亚基双功能酶5-7bp非对称非对称距识别序列下游距识别序列下游24-26bp处处同时竞争同时竞争ATP Mg2+种类少，用途小种类少，用途小2023-11-14西南大学生物技术专业 基因工程8二、限制酶识别的序列二、限制酶识别的序列1、限制酶识别序列的长度、限制酶识别序列的长度(n)：一般为：一般为4-8个碱基对，最常个碱基对，最常见为见为6bp。识别位点出现频率：识别位点出现频率：4n2、限制酶识别序列的结构、限制酶识别序列的结

9、构：多数为：多数为回文结构（回文结构（palindrome）即镜像对称结构。即镜像对称结构。一些酶可识别多种结构尤其是允许一些碱基是简并的，一些酶可识别多种结构尤其是允许一些碱基是简并的，还有一些酶识别序列呈间断对称，即回文对称序列之间可以还有一些酶识别序列呈间断对称，即回文对称序列之间可以间隔一定长度的任意碱基。间隔一定长度的任意碱基。3、限制酶的切割位置、限制酶的切割位置：多数在识别序列内部，也有在外部、：多数在识别序列内部，也有在外部、两端、两侧或单侧的。两端、两侧或单侧的。三、三、限制酶的功能和产生的末端类型限制酶的功能和产生的末端类型限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸限

10、制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解内切方式水解DNADNA链中的磷酸二酯键，产生的链中的磷酸二酯键，产生的DNADNA片段片段5 5端端为为P P，33端为端为OHOH，识别序列一般为，识别序列一般为4 46 6个碱基对，通常是个碱基对，通常是反向重复顺序，具有反向重复顺序，具有180180的旋转对称性，即的旋转对称性，即回文结构回文结构。限制性核酸内切酶切割双链限制性核酸内切酶切割双链DNADNA产生产生3 3种不同的末端类型种不同的末端类型。1 1、对称型突出末端：回文结构决定对称，分为、对称型突出末端：回文结构决定对称，分为5 5突出和突出和3 3突突出的粘性末端

11、（出的粘性末端（cohesive/sticky endcohesive/sticky end）两种。）两种。2 2、平末端（、平末端（blunt endblunt end）：任何平末端酶的酶切产物可以互）：任何平末端酶的酶切产物可以互连，但连接效率比粘性末端低连，但连接效率比粘性末端低100100倍左右。倍左右。3 3、非对称的突出末端：、非对称的突出末端：因为识别序列是非回文的、简并的或因为识别序列是非回文的、简并的或存在间隔序列，故产生的粘性末端也为非对称的。即使是存在间隔序列，故产生的粘性末端也为非对称的。即使是单酶切限制片段在连接时也具有方向性。单酶切限制片段在连接时也具有方向性。4

12、4、同裂酶（、同裂酶（isoschizomerisoschizomer）：）：不同的酶识别序列相同，切割不同的酶识别序列相同，切割位点可以相同也可以不同，又分为同序同切酶、同序异切酶、位点可以相同也可以不同，又分为同序同切酶、同序异切酶、同功多位酶和其它类型。同功多位酶和其它类型。例：例：SmaSma(CCCGGG)(CCCGGG)和和XmaXma(CCCGGG)(CCCGGG)5 5、同尾酶（、同尾酶（isocaudarnerisocaudarner）：）：不同限制酶识别序列可以相同，不同限制酶识别序列可以相同，也可以不同，但它们产生的末端是一样的，末端间可以相互也可以不同，但它们产生的末端

13、是一样的，末端间可以相互连接。同尾酶在基因工程尤其是载体构建中有较大用途。连接。同尾酶在基因工程尤其是载体构建中有较大用途。例：例：XhoXho(C(CTCGATCGAG)G)与与SalSal(G(GTCGATCGAC)C)、BamBamHI(GHI(GGATCGATCC)C)和和BglBgl(A(AGATCGATCT)T)6 6、归位内切酶（、归位内切酶（homing endonucleasehoming endonuclease）：一些线粒体、叶绿）：一些线粒体、叶绿体、核体、核DNADNA和和T T偶数噬菌体的内含子编码内切酶（称为偶数噬菌体的内含子编码内切酶（称为I-I-prefixp

14、refix）或内含肽（）或内含肽（inteinintein）具有内切酶活性（称为）具有内切酶活性（称为PI-PI-prefixprefix）。它们识别序列很长，核心识别序列一般为）。它们识别序列很长，核心识别序列一般为10-10-12bp12bp，识别位点极少。，识别位点极少。2023-11-14西南大学生物技术专业 基因工程14四、四、DNADNA末端长度对限制酶切割效率的影响末端长度对限制酶切割效率的影响限制性核酸内切酶识别和切割靶序列时需要识别序列两侧具限制性核酸内切酶识别和切割靶序列时需要识别序列两侧具有一定长度的有一定长度的DNADNA，否则会降低切割效率。，否则会降低切割效率。对侧

15、翼长度敏感性较低的酶有对侧翼长度敏感性较低的酶有EcoEcoRR等，只要一个侧翼碱基等，只要一个侧翼碱基即保证即保证90%90%的效率。的效率。对侧翼长度敏感性高的酶有对侧翼长度敏感性高的酶有AccAcc、HinHindd、PstPst等，侧翼等，侧翼3 3个碱基以上也未必理想。个碱基以上也未必理想。设计引物、接头等时要考虑适当长度的保护碱基，载体构建设计引物、接头等时要考虑适当长度的保护碱基，载体构建时多克隆位点中的相临位置的酶的切割序列的选择也很重时多克隆位点中的相临位置的酶的切割序列的选择也很重要。要。限制酶的活性单位（限制酶的活性单位（unitunit）：）：1 1个单位的酶是指在建议

16、的缓冲个单位的酶是指在建议的缓冲液及温度下，在液及温度下，在2020l反应液中反应反应液中反应1h，使，使1g DNA（多用（多用）完全消化所需要的酶的量。）完全消化所需要的酶的量。五、位点偏爱五、位点偏爱某些限制酶对同一底物中的不同位置的识别位点的切割效率不某些限制酶对同一底物中的不同位置的识别位点的切割效率不同，表现出偏爱性，这种现象称作同，表现出偏爱性，这种现象称作位点偏爱位点偏爱。某些噬菌体某些噬菌体DNADNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性不同。中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性不同。噬菌体噬菌体DNADNA为为48502bp48502bp，两端为，两端为12bp12bp粘性末端。粘性末端。EcoEcoRR酶切酶切割割噬菌体中的噬菌体中的5 5个位点时并不是随机的，靠近右端的位点个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快比分子中间的位点切割快1010倍；倍；EcoEcoRR对腺病毒对腺病毒2DNA2DNA不同位不同位置切点的切割速率也不同。置切点的切割速率也不同。由于位点偏爱性，由于位点偏爱性，DNA DNA用用HinHindd消化而制备的消化而制备的 H