第18章酵母双杂交系统.ppt

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1、第十八章第十八章 用酵母双杂交系统用酵母双杂交系统研究蛋白质研究蛋白质-蛋白质蛋白质相互作用相互作用蛋白质之间相互作用研究的重要蛋白质之间相互作用研究的重要性性 蛋白质之间相互作用以及通过相互作用蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括几乎所有的重要生命活动，包括DNA的的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。作用。研究蛋白质相互作用的常用方法研究蛋白质相

2、互作用的常用方法酵母双杂交（酵母双杂交（yeast two hybridization）亲和层析亲和层析免疫共沉淀免疫共沉淀蛋白质交联蛋白质交联基于基于GFPGFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方的细胞内蛋白质相互作用的研究方法法噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母酵母中进行的，研究中进行的，研究活细胞内活细胞内蛋白质相互作用，蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因报告基因的表达产物敏感地检测得到。的表达产物敏感地检测得到。第一节第一节 酵母双杂交系统简介酵母双杂交系统

3、简介 它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。间关系的技术。该技术既可用来研究该技术既可用来研究哺乳动物哺乳动物基因组编码基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等高等植物植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。基因组编码的蛋白质之间的相互作用。一、酵母双杂交系统的建立和基本原理一、酵母双杂交系统的建立和基本原理经典文献出处经典文献出处vFields S,Song O.A novel genetic system to detect protein-protein interactions.Nature,1

4、989,340(6230):245-246（一）酵母双杂交系统的建立（一）酵母双杂交系统的建立 1989年美国纽约州立大学的年美国纽约州立大学的Fields和和Song首先描述首先描述了酵母双杂交系统了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：转录激活因子转录激活因子DNA结合结构域结合结构域(BD)(DN

5、A binding domain)转录激活结构域转录激活结构域(AD)(activation domain)这两个结构域各具功能，互不影响这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。特定基因表达的激活因子的功能。Gal4为酵母半乳糖苷酶基因为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活的转录激活因子，天然的因子，天然的Gal4分子是由一条由分子是由一条由881个氨基个氨基酸残基组成的

6、多肽链。酸残基组成的多肽链。两个结构域中的两个结构域中的DNA-BD由位于由位于N-末端的末端的1147位多肽构成，能识别位于位多肽构成，能识别位于Gal4基因的上基因的上游激活序列游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。此外，在其此外，在其N-端还具有一段核定位序列。端还具有一段核定位序列。AD由位于由位于C-末端的末端的768881位多肽构成。位多肽构成。当当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转作为转录因子的活性。录因子的活性。Fields和

7、和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将质粒上，一个是将Gal4的的DNA-BD与酵母蛋白与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将融合；另一个是将Gal4的的AD和酵母蛋白和酵母蛋白SNF4融合。融合。其中，其中，SNF1是一种丝氨酸是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激苏氨酸的蛋白激酶，酶，SNF4是它的一个结合蛋白，是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是这两种蛋白是已知可以相互作用的已知可以相互作用的。当两种穿梭质粒共转化含有当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报结合位点的报告基因告基因LacZ的酵母菌株后，通过的酵母菌株后，通过SNFl与与SNF4的的相互作用，

8、相互作用，Gal4的的DNA-BD与与Gal4的的AD靠近靠近,形形成一个大的复合物成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的的DNA-BD可识别位于可识别位于Gal4效应基因的效应基因的UAS，并可与之结合；，并可与之结合；Gal4的的AD则可与转录复合物中其他成分结合，则可与转录复合物中其他成分结合，激活激活UAS下游报告基因下游报告基因LacZ的转录。的转录。酵母转录因子（酵母转录因子（Gal 4）与与BD-fusion -诱饵（诱饵（bait）与与AD-fusion -猎物或靶蛋白（猎物或靶蛋白（prey or target protein）报告基因（

9、报告基因（reporter gene）-Lac Z（编码（编码-半乳糖苷酶）半乳糖苷酶）（二）酵母双杂交系统的原理（二）酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter geneXDNA-BD酵母双杂交动画演示酵母双杂交动画演示（英文）（英文）酵母细胞酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点许多优点:v

10、 易于转化、便于回收扩增质粒易于转化、便于回收扩增质粒v 具有可直接进行选择的具有可直接进行选择的和特征性和特征性v 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相 互结合互结合报道株报道株 经经的、含报告基因的重组质粒的宿的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。主细胞。v 基因组中基因组中是缺失型的是缺失型的v 基因组中引入额外的报告基因基因组中引入额外的报告基因、改造后的酵母细胞的特点：改造后的酵母细胞的特点：通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落 表达表达“诱饵诱饵”和和“猎物猎物”蛋白；蛋白；检验这两种蛋白表达后能

11、否激活酵母中的报检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。告基因。做法：首先构建能表达做法：首先构建能表达“诱饵诱饵”和和“猎物猎物”蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。筛选的基因。二、酵母双杂交系统的基本策略二、酵母双杂交系统的基本策略三、酵母双杂交系统的优点三、酵母双杂交系统的优点1.高敏感性。高敏感性。原因：原因：采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；蛋白过量表达；激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复

12、合体使融合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；合蛋白各组分间结合更趋于稳定；通过通过mRNA使信号放大；使信号放大；检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。三、酵母双杂交系统的优点三、酵母双杂交系统的优点1.高敏感性。高敏感性。2.真实性。真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。3.简洁性。简洁性。融合蛋白相互作用后

13、，减少了制备抗体和融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。纯化蛋白质的繁琐步骤。4.广泛性。广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。蛋白。分析已知蛋白之间的相互作用分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。突变或缺失突变再进行双杂交。用已知功能蛋白质筛选双杂交用

14、已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。绘制蛋白质相互作用系统图谱绘制蛋白质相互作用系统图谱 在药物设计中的应用在药物设计中的应用四、酵母双杂交系统的应用现状四、酵母双杂交系统的应用现状利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质 的新功能的新功能 将已知基因作为将已知基因作为诱饵诱饵，在选定的

15、，在选定的cDNA文库中文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到酵母菌株中可以分离得到AD-文库载体，并从载体文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片片段，并对该片段的编码序列在段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。已知基因在生物学功能上的联系。利用酶联免疫（利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可研究抗原技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可研

16、究抗原和抗体之间的相互作用，但它们都是基于和抗体之间的相互作用，但它们都是基于体外非细胞体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞细胞体内体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。进行检测。利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和 抗体的相互作用抗体的相互作用利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及 药物对蛋白质之间相互作用的影响药物对蛋白质之间相互作用的影响 对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作可采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。用以达到治疗疾病的目的。利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 （Genome Protein Linkage Map）基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的联系。通过基因