第16章同位素示踪在植物病理学研究中的应用.ppt

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1、第第16章章.示踪技术在植物病理学示踪技术在植物病理学研究中的应用研究中的应用第第16章章.示踪技术在植物病理学研究中的示踪技术在植物病理学研究中的应用应用1 1 病原微生物的标记病原微生物的标记 1.11.1直接法直接法 通过标记培养基而标记病原微生物的方通过标记培养基而标记病原微生物的方法。将适合的放射性核素或其标记化合物法。将适合的放射性核素或其标记化合物,加加入培养基入培养基,然后接种病原微生物然后接种病原微生物,通过培养使通过培养使其摄取放射性而获得标记其摄取放射性而获得标记,该法仅限于非专性该法仅限于非专性寄生微生物的标记。寄生微生物的标记。q 方法要点方法要点1)1)培养基培养基

2、 适合的普通培养基。适合的普通培养基。2)2)标记核素标记核素 常用常用1414C C、3232P P、3535S S，如，如1414C-C-葡萄葡萄糖，糖，1414C-C-蔗糖，蔗糖，3232P-KHP-KH2 2POPO4 4。3)3)放射性活度放射性活度 MBqMBq/ml/ml的范围的范围 为了避免刮取菌落时被放射性培养基粘为了避免刮取菌落时被放射性培养基粘污可用双层培养法。污可用双层培养法。平板培养时，先在含放射性的培养平板培养时，先在含放射性的培养基上接种培养，待菌落铺满后，再在上基上接种培养，待菌落铺满后，再在上面铺上一层非放射性培养基，经过一段面铺上一层非放射性培养基，经过一段

3、时间，菌絲将透过上层培养基，这样获时间，菌絲将透过上层培养基，这样获得的标记菌落，可避免放射性培养基污得的标记菌落，可避免放射性培养基污染。染。1.2 1.2 间接法间接法 对专性寄生菌，如锈菌，白粉菌，病毒等应对专性寄生菌，如锈菌，白粉菌，病毒等应先标记寄主，通过寄生关系使病原微生物得到标先标记寄主，通过寄生关系使病原微生物得到标记。记。1 1）寄主植物）寄主植物 先标记后接种，用一般植物标记先标记后接种，用一般植物标记法进行标记，干组织应具有法进行标记，干组织应具有0.37 0.37 10104 4 3.7 3.7 10104 4 BqBq/ml/ml。2 2）寄主真菌）寄主真菌 如以真菌

4、为食料的线虫体如以真菌为食料的线虫体,先培养先培养并标记交链孢霉菌并标记交链孢霉菌,取得标记的孢霉菌后取得标记的孢霉菌后,在其体在其体上接种线虫体进行标记。上接种线虫体进行标记。3 3）寄主细菌）寄主细菌 通过标记细菌使其专性寄生噬通过标记细菌使其专性寄生噬菌体得到标记。先标记细菌，菌体得到标记。先标记细菌，洗去放射性粘洗去放射性粘污，配成放射性菌液，然后接种噬菌斑，经污，配成放射性菌液，然后接种噬菌斑，经培养止混浊悬浮液变清，表明细菌已几乎被培养止混浊悬浮液变清，表明细菌已几乎被吞食，用细菌过滤器过滤，可获得纯的标记吞食，用细菌过滤器过滤，可获得纯的标记噬菌体。噬菌体。1.31.3标记检测标

5、记检测 制备的标记病原微生物可用于病原微生物与制备的标记病原微生物可用于病原微生物与寄主间相互关系、病害侵染规律、致病机理等方寄主间相互关系、病害侵染规律、致病机理等方面研究。在应用前要洗净表面的放射性粘污和测面研究。在应用前要洗净表面的放射性粘污和测定其浓度或比活度。定其浓度或比活度。1 1）洗涤）洗涤 一般采用徒手振荡，减压抽滤或离心洗一般采用徒手振荡，减压抽滤或离心洗涤法，洗至下洗液无明显放射性或接近本底为止。涤法，洗至下洗液无明显放射性或接近本底为止。2 2）测定）测定 3232P P标记的真菌，可用固型闪烁倍杯法测标记的真菌，可用固型闪烁倍杯法测量，量，1414C-C-标记的真菌、线

6、虫、细菌等病原生物，标记的真菌、线虫、细菌等病原生物，可取其悬浮液，用液闪测量，感病生物的患病部可取其悬浮液，用液闪测量，感病生物的患病部位，可用相应制样法制备样品并测量。位，可用相应制样法制备样品并测量。2 2 病害侵染途经的研究病害侵染途经的研究 探明病害的侵染途经可为制定防冶措施提供探明病害的侵染途经可为制定防冶措施提供依据。通过一定方法接种病菌后，定时对客体进依据。通过一定方法接种病菌后，定时对客体进行空间取样检测或进行自显影，便可确定病菌的行空间取样检测或进行自显影，便可确定病菌的侵染途经、过程及规律。侵染途经、过程及规律。2.1 2.1 土壤病害侵染途经土壤病害侵染途经 土传病害，

7、主要由真菌或线虫引起。进行研土传病害，主要由真菌或线虫引起。进行研究时，病原微生物常用直接拌土壤法究时，病原微生物常用直接拌土壤法,或制成菌液或制成菌液或孢子悬浮液浇灌植株周围土壤的方法引进或孢子悬浮液浇灌植株周围土壤的方法引进,使其使其繁殖达到侵染的目的繁殖达到侵染的目的,然后定期对植珠取样进行放然后定期对植珠取样进行放射测定或自显影射测定或自显影,判明示踪菌的侵染途经及其在寄判明示踪菌的侵染途经及其在寄主中的分布。主中的分布。2.2 2种子传播病害途经种子传播病害途经 种子传播的病害也为数不少种子传播的病害也为数不少,如水稻白叶如水稻白叶枯病枯病,小麦黑粉病小麦黑粉病,棉花炭疽病。通常用侵

8、种棉花炭疽病。通常用侵种法标记病原生物法标记病原生物,检测病原菌由种子侵入幼苗检测病原菌由种子侵入幼苗及其过程及其过程,以揭示侵染规律和发病机制以揭示侵染规律和发病机制,开花开花期侵染的病菌期侵染的病菌,可在花期于穗部微喷孢子悬浮可在花期于穗部微喷孢子悬浮液方法接种液方法接种,接种后要套代保湿。接种后要套代保湿。2.3 2.3 虫媒病害侵染途经虫媒病害侵染途经 常用间接标记法常用间接标记法,即先标记病原植物即先标记病原植物,再再接种昆虫使其吸取标记毒原而标记接种昆虫使其吸取标记毒原而标记,然后将其然后将其接种于寄主接种于寄主,研究虫媒侵染过程。研究虫媒侵染过程。2.4 4 其它病害侵染途经其它

9、病害侵染途经 主要通过杂草主要通过杂草,空气与雨水等途经的传空气与雨水等途经的传播。因为可能招致环境放射污染播。因为可能招致环境放射污染,使用受到限使用受到限制制,但在严格控制的条件下但在严格控制的条件下,一些研究可能提一些研究可能提供有价值的信息。禹王树（供有价值的信息。禹王树（19861986）在稻株接）在稻株接种种1414C C白叶枯细菌，不但当年发病期在田边杂白叶枯细菌，不但当年发病期在田边杂草能检测出放射性，而且次年草能检测出放射性，而且次年1515种杂草也能种杂草也能检出，表明水稻白叶枯病可以通过田边杂草检出，表明水稻白叶枯病可以通过田边杂草传播病害传播病害。3 3 植物病害检测与

10、诊断植物病害检测与诊断 植物病害诊断与植物检疫工作中，放射植物病害诊断与植物检疫工作中，放射免疫分析以及后来发展起来的酶联吸附免疫免疫分析以及后来发展起来的酶联吸附免疫分析（分析（ELISAELISA）法）法,因较传统的血清检验（琼因较传统的血清检验（琼脂糖平板）等方法要灵敏得多，可以检测已脂糖平板）等方法要灵敏得多，可以检测已感染带毒而尚无症状的植物、定量检测病原感染带毒而尚无症状的植物、定量检测病原菌侵染的数量或产生的代谢毒素，因此被作菌侵染的数量或产生的代谢毒素，因此被作为病害初期诊断与预报及检疫的重要手段，为病害初期诊断与预报及检疫的重要手段，用于作为进一步进行其它研究的基础。用于作为

11、进一步进行其它研究的基础。3.1 1检测的一般程序检测的一般程序 1 1）试剂制备）试剂制备 培养病原菌培养病原菌 免疫免疫 标记标记 普通普通 杂交瘤杂交瘤 标记抗原标记抗原 多克隆抗体多克隆抗体 单克隆抗体单克隆抗体 （PcAbPcAb）(McAb)(McAb)标记标记 标记抗体标记抗体 2)样品制备样品制备 植物试样经匀浆或液氮冷冻研磨用缓冲液提植物试样经匀浆或液氮冷冻研磨用缓冲液提取，上清液用于测试。取，上清液用于测试。3)测试程序测试程序 测定可采用基于饱和竞争结合的放射免疫测定可采用基于饱和竞争结合的放射免疫（RIA)RIA)或免疫放射分析。或免疫放射分析。固相载体（聚乙烯）固相载

12、体（聚乙烯）包被抗体（包被液）包被抗体（包被液）(V.T.tV.T.t）拍干洗涤（洗涤液）拍干洗涤（洗涤液）封板（封闭液）封板（封闭液）加入样品或标准加入样品或标准+抗原抗原*（反应液）（反应液）温浴温浴 （T.tT.t）洗涤洗涤 （洗涤液）（洗涤液）测量测量B B，B/BB/B。=f(Ag):Ag=f=f(Ag):Ag=f-1-1 (B/B(B/B。)。3.23.2应用举例应用举例序序号号检测对象检测对象 方法方法作者作者年代年代1水稻白叶枯病菌水稻白叶枯病菌 RIA RIA 董以德董以德198119812水稻矮缩病毒水稻矮缩病毒 IRMAIRMA金子渔金子渔198619863水稻细菌性条斑

13、病水稻细菌性条斑病 125125I-AI-A蛋白蛋白 王公金王公金199019904小麦花叶病毒小麦花叶病毒 ELISAELISA刘常宏刘常宏199519955棉铃虫核多角体病毒棉铃虫核多角体病毒 ELISAELISA陆字融陆字融199519956香蕉束顶病毒香蕉束顶病毒 ELISAELISA范国成范国成199919997玉米种子携带的玉米种子携带的MDMV MDMV ELISA ELISA 马占鸿马占鸿199719978葡萄扇叶病毒葡萄扇叶病毒 ELISAELISA 谷洪包谷洪包19941994 4 4病理学研究的相关技术病理学研究的相关技术 阐明病源微生物与寄主之间致病与抗病这一阐明病源微

14、生物与寄主之间致病与抗病这一对矛盾的相互作用机理，对于充分利用抗病资源，对矛盾的相互作用机理，对于充分利用抗病资源，克服植物病害具有重要意义。在分子水平上，病克服植物病害具有重要意义。在分子水平上，病原微生物在侵染寄主时，首先会释放某种称为激原微生物在侵染寄主时，首先会释放某种称为激发子的信号物质，通过与寄主细胞表面受体作用，发子的信号物质，通过与寄主细胞表面受体作用，启动相应的基因开关，使其表达并产生一系列次启动相应的基因开关，使其表达并产生一系列次级代谢物，以决定寄主对侵染的反应，致病微生级代谢物，以决定寄主对侵染的反应，致病微生物可以避开寄主的防卫系统，而使其染病，产生物可以避开寄主的防

15、卫系统，而使其染病，产生诸如如下破坏：真菌产生破坏诸如如下破坏：真菌产生破坏寄主细胞的酶类寄主细胞的酶类（如角质酶，果胶酶，纤维素酶，磷酸酶，蛋白（如角质酶，果胶酶，纤维素酶，磷酸酶，蛋白酶等），酶等），使寄主组织软腐坏死，利用寄主的蛋白和核使寄主组织软腐坏死，利用寄主的蛋白和核酸合成系统进行自身繁殖，多数病毒属于此酸合成系统进行自身繁殖，多数病毒属于此类；分泌毒素破坏寄主正常代谢；分泌阻塞类；分泌毒素破坏寄主正常代谢；分泌阻塞寄主导管的物质，致使其枯萎；产生植物激寄主导管的物质，致使其枯萎；产生植物激素，破坏寄主的激素平衡。而植物的诱导抗素，破坏寄主的激素平衡。而植物的诱导抗病性则是由植物抗

16、病基因与病原无毒基因相病性则是由植物抗病基因与病原无毒基因相互识别后，诱导的防卫反应决定的。寄主可互识别后，诱导的防卫反应决定的。寄主可以通过多种方式抵御病原侵染，如加固细胞以通过多种方式抵御病原侵染，如加固细胞进行屏蔽，合成植保素，诱导各种病程相关进行屏蔽，合成植保素，诱导各种病程相关蛋白等蛋白等 。在植物各个病理反应阶段的研究，可以在植物各个病理反应阶段的研究，可以使用的示踪相关技术如下：使用的示踪相关技术如下：4.14.1显微免疫定位显微免疫定位 利用放射性显影或荧光显像技术，对病利用放射性显影或荧光显像技术，对病源微生物或其激发子等配体的特异受体进行源微生物或其激发子等配体的特异受体进行组织、细胞或分子水平的定位。方法是对配组织、细胞或分子水平的定位。方法是对配体进行放射性或荧光标记，经体内引入或体体进行放射性或荧光标记，经体内引入或体外组织或细胞孵育，利用显影技术，显示受外组织或细胞孵育，利用显影技术，显示受体类型及分布情况，也可以利用免疫化学方体类型及分布情况，也可以利用免疫化学方法显示，即非标记配体法显示，即非标记配体-受体作用后，利用标受体作用后，利用标记抗配体抗体进行