高通量药物筛选.ppt

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1、高通量药物筛选高通量药物筛选高通量药物筛选高通量药物筛选 高通量药物筛选（high throughput screening，HTS），是指用现代科技手段，对可能作为药用的物质进行大规模的生物活性检测，从而寻找出具有药用价值的物质，为新药的开发研究奠定基础。高通量药物筛选的形成 高通量药物筛选是20世纪80年代后期发展起来的高新技术。它主要由生物高通量和药物筛选结合而成。所谓的高通量就是以新的药物作为靶点，对药物的作用进行研究；而药物筛选可以简略的解释为重复性实验操作。高通量药物筛选的出现，使药物筛选逐步实现规模化、自动化和集成化，具有筛选速度快，所需样品用量少的特点。传统药物筛选高通量药物筛

2、选药物作用分子靶点药物筛选活性化合物作用机制研究组织、器官水平研究药效学研究疾病相关动物模型研究人类疾病相关动物模型药物筛选发现有效药物活性化合物药效学研究组织器官水平研究作用机制研究分子细胞水平研究药物开发研究高通量筛选与组合化学 组合化学应用组合合成的方法，可以在短时间内合成出含有102106个化合物的化学库，为高通量药物筛选提供了物质基础。高通量筛选与组合化学 组合化学实现了组合库的虚拟化，从而可以根据合成目标，获得一个虚拟组合库。然后通过相关软件，从虚拟组合库中筛选出，可能实现的、符合目标要求的药物化学式，这就得到了实验组合库。通过对虚拟组合库的优化，可以大大减少实验组合库的药物数量，

3、这为我们节省了大量的时间和资源。新药的发现过程：1.合成化合物，2.纯化，3.鉴定结构，4.进行生物活性的测定。传统合成方法是要逐一合成，这种方法效率低、速度慢、成本高、周期长。高通量筛药物选利用组合合成方法同时和成大量化合物，然后通过生物高通量方法，对大量化合物进行高速、高效、低成本、微量化的筛选，并促进了许多新的生物活性评价方法。高通量筛选生物活性评价方法：1.组合化学样品的准备2.药理活性评价3.细胞毒性评价4.药代动力学评价5.高信息筛选技术1.组合化学样品的准备：样品登记称量稀释转运标记具体操作：样品登记时涉及样品名称、理化性质、测试目的等内容，样品入库后称取一定量并用相应的溶剂（常

4、用而甲基亚砜）溶解后作为母液共筛选用，然后经过稀释制备工作液，实验室一般工作液分布在96孔板上，每板可以分布80个样品，剩余16个孔作为筛选时设置各种对照。一般母液经过2次100倍稀释后即可作为工作液供筛选使用。2.药理活性评价1.靶点的选择 受体结合分析法、酶活性测定法、细胞活性因子测定法、代谢物质测定法、细胞活性测定法等。2.药理活性结果评价 阳性率法、活性指标法、阳性药标准。对于同一结构类型、具有活性的化学样品，应将该类化合物作为一组样品，选取活性较好的样品进行进一步研究，并分析其构效关系。对于毒性较大的化学样品，就要比较其最小有效浓度和最低毒性浓度差距，然后判断其药用价值。对于结构类型

5、完全不同的化学样品，通过活性综合分析，判断样品的药理作用的选择性。若该样品只在特定模型中表现活性，且选择性较好，则具有特定方面的开发价值；若在多种模型上都表现活性，则需通过综合资料分析其是否具有药用价值，然后再做进一步药理价值研究。3.细胞毒性评价 细胞毒性终点包括细胞吸附、迁移、凋亡、分裂、分化和坏死等。因细胞的生长抑制具有较好的毒性预测性，常选择单一来源的细胞进行高通量细胞毒性筛选作为毒性的初筛。细胞毒性检测方法有：化学染料法、MTT法、LDH法、放射性核素标记法、荧光法、化学发光法、生物发光检测法。4.药代动力学评价 这是一种通过建立研究候选化合物吸收、分布和代谢的体外筛选模型，根据药理

6、学、毒理学和药动学筛选结果反馈来指导下一步的合成或改造。目前常用的模型有：肝切片、培养的肝细胞、亚细胞部分如S9及肝微粒体等。5.高信息筛选技术 高信息筛选技术是指通过软件（常用ArrayscanTM和ImageProTM）获得高分辨率的图像，从而获得单个细胞、细胞器和细胞内药靶的多方位信息。图像一般可以反映多种细胞毒性的指征：细胞密度、溶解后pH、细胞形态、核形态和膜通透性等。高通量筛选常用分析技术1.荧光分析法2.放射性分析技术3.比色技术4.发光检测技术5.核磁共振技术荧光分析法 荧光分析法的特点：灵敏度高、易于检测、实验条件简单、可以实现筛选体系的微量化等。荧光分析法包括:1.荧光强度

7、分析法2.均相时间分辨荧光法（HTRF）3.极化荧光法（FP）4.荧光共振能量传递分析法（FRET）5.时间分辨荧光能量传递分析法（TRET）6.荧光关联光谱法（FCS）荧光强度分析法原理：许多分子带有天然荧光基团，当待测大分子本身的荧光团不够强烈而无法检测时，可结合一些荧光染料以加强其光谱特征，然后根据其荧光强度的变化进行检测。时间分辨荧光分析 原理：利用激发波长、发射波长和荧光寿命的变化，对物质进行检测。该方法具有灵敏度高、无放射性危害、标记物稳定、线性范围宽、分析速度快和操作简便等优点，受到广大药物筛选工作者的关注。荧光极化（荧光偏振）原理：当处于激发期的可自由运动的荧光团分子，被平面极

8、化的光激发，使其发射到一个固定平面，分子间的旋转碰撞导致发射光平面与激发光平面产生差别，导致极化值变化，从而进行检测。适用于：酶催化水解的检测、蛋白质互相作用、DNA诊断、生物膜的流动性变化、高通量筛选。荧光共振能量传递分析法原理：在合适的能量供体和能量受体分子间，提供一定的条件，即当供体激发态能量满足光学和空间上的要求时，能量就会有效转移给受体，通过记录能量转移接受体的接收时间来进行检测。时间分辨能量传递分析方法原理：常范围能量传递在荧光镧复合物和共振能力安防受体之间。优点：受体长期存活和受体信号的时间通过减少背景具有高的灵敏度，无需对试剂进行特殊处理、检测或沉淀。适用于检测大量天然产物。放

9、射性分析技术，主要应用于检测RNA转录，测定P56激酶活性，对氨基乙酰化tRNAd进行测定以及肝炎C病毒NS3蛋白酶抑制剂的药物筛选等方面。比色技术，用于检测具有吸收性质的物质浓度，根据光线经过被检物质后被吸收的多少，来评价吸收物质的含量。是目前应用最广泛的一向检测法。核磁共振技术，通过改变碰撞能，测定复合体解离时的能量，测得配体的亲和力。在应用于NMR研究小分子化合物与生物大分子相互作用时具有明显优势。发光检测技术，有些生物和化学物质可以在一定条件下进行化学反应，产生发光现象，根据这些发光反应产生的光线强弱，判断反应的进行程度。高通量药物筛选的基本步骤：高通量药物筛选模型的建立操作程序的编制带筛样品的准备筛选的实施数据分析药物发现的基本过程初筛和复筛（分子、细胞水平）深入筛选（综合分析获得先导化合物）确证筛选（确定开发前景并进行临床研究）高通量药物筛选的前景 高通量药物筛选只经过十余年的实践检验，在药理发现理论研究、技术方法的研究及筛选结果评价的研究方面，任需要完善。而如何提高高通量药物筛选的效率和准确性，是目前亟需解决的重要问题。