质粒提取实验11.ppt

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1、分子生物学实验分子生物学实验n重组DNA技术n质粒DNA的提取n琼脂糖凝胶电泳复复 制制翻翻 译译转转 录录不同来源的不同来源的DNADNA分子通过磷酸二酯键连接成新的分子通过磷酸二酯键连接成新的DNADNA分子，这一分子，这一过程称为过程称为DNADNA重组。重组。不同来源不同来源的的DNADNA分子分子重组重组DNADNA分子分子重组DNA技术基基本本过过程程载体载体 携带目的基因转移至受体细胞的一种能自携带目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的我复制的DNA分子。分子。作用：作用：1 1、携带目的基因进入受体细胞、携带目的基因进入受体细胞2 2、使外源、使外源DNADNA在宿主细胞复制

2、扩在宿主细胞复制扩增或表达。增或表达。载体的特点载体的特点1.1.对受体细胞无害，不影响受体细胞正常对受体细胞无害，不影响受体细胞正常生命活动生命活动2.2.具有自主复制能力具有自主复制能力3.3.含有多克隆酶切位点含有多克隆酶切位点4.4.携带标记基因、便于筛选携带标记基因、便于筛选5.5.除保留必要序列外，载体应尽可能小除保留必要序列外，载体应尽可能小6.6.生物安全性好生物安全性好载体的类型质粒噬菌体病毒质粒质粒 存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子。分子。第一次实验第一次实验第二次实验第二次实验第三次实验第三次实验选选切、切、连连转转筛

3、筛质粒DNA的提取方法：方法：碱裂解法碱裂解法原理：原理：质粒质粒DNA与染色体与染色体DNA变性与复性的差异变性与复性的差异将菌液转移至将菌液转移至1.5ml离心管中离心管中(尽量倒满尽量倒满)12000rpm/30s（重复一次重复一次）弃上清弃上清扣干，加入扣干，加入Solution 100L,剧烈振荡剧烈振荡打散菌体，室温打散菌体，室温3min （以下操作要轻柔）（以下操作要轻柔）加入新配制的加入新配制的Solution 200L,温和颠倒温和颠倒离心管离心管45次混匀，室温放置次混匀，室温放置3min （此时出现拉丝现象）（此时出现拉丝现象）加入预冷的加入预冷的Solution 150

4、L,温和颠倒温和颠倒离心管离心管23次混匀，室温次混匀，室温3min 离心离心12000rpm/5min具体步骤具体步骤 质粒质粒DNA的的上清上清400 L移至另一离心管中移至另一离心管中 加等体积加等体积氯仿氯仿,轻微振荡轻微振荡 离心离心12000rpm/2min 转移转移上清液上清液350 L至另一离心管至另一离心管 加入加入2倍体积倍体积无水乙醇无水乙醇,轻轻混匀室温放置轻轻混匀室温放置2min 离心离心12000rpm/5min 弃上清弃上清,加入加入70%乙醇乙醇洗涤沉淀洗涤沉淀 离心离心12000rpm/2min（重复一次重复一次）弃上清弃上清，液体尽量倒净并在吸水纸上扣干，液

5、体尽量倒净并在吸水纸上扣干 室温放置室温放置15min干燥干燥 加入加入TER 40L 溶解质粒溶解质粒具体步骤具体步骤Solution I1、蔗糖：增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械、蔗糖：增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏剪切作用，防止破坏DNA。2、Tris-Cl：使溶液维持最适：使溶液维持最适pH范围。范围。3、EDTA：螯合掉：螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，抑等二价金属离子，抑制制DNA酶活性，防止其对酶活性，防止其对DNA分子的降解作用。分子的降解作用。蔗糖蔗糖+Tris+EDTASolution II1.SDS：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分：

6、破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性子结合使之变性2.NaOH：破坏氢键，使破坏氢键，使DNA分子变性分子变性SDS+NaOHSolution III1.中和溶液中和溶液II的碱性，使的碱性，使DNA复性。复性。2.K+离子会与离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也也会与蛋白质会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒很容易与小分子的质粒DNA分离。分离。KAc 与与HAc质粒的鉴定质粒的鉴定琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳n电泳电泳：带电

7、粒子在电场中向着与其电性相反的电：带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动的现象。极移动的现象。n作用：作用：用于生物物质的分离分析用于生物物质的分离分析 用于分析物质的纯度和分子量的测定等用于分析物质的纯度和分子量的测定等电泳基本原理电泳基本原理当粒子稳定运动时：当粒子稳定运动时：F=F 即即 EQ=6r /E表示表示电泳迁移率电泳迁移率，即单位电场强度粒子的运，即单位电场强度粒子的运动速度，以动速度，以表示：表示：=/E=Q/6r影响电泳的因素影响电泳的因素n溶液的pH值n电场强度n缓冲液的离子强度n电渗作用琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶分离范围凝胶浓度（凝胶浓度（%）线性线性DNA长度（长度（bp）0.51000300000.7800120001.0500100001.240070001.520030002.0502000实验流程实验流程 注意事项注意事项1、制胶槽一定要放平、制胶槽一定要放平2、倒胶时要慢，防止产生气泡、倒胶时要慢，防止产生气泡1、与上样、与上样缓冲液、染液缓冲液、染液混匀混匀2、避免产生气泡、避免产生气泡3、小心防止戳破凝胶、小心防止戳破凝胶1、看准正负极、看准正负极2、确定电路联通再离开、确定电路联通再离开3、及时停止、及时停止防止紫外线伤害防止紫外线伤害