酰基转移酶alcoholacyltransferaseAAT活性测定试剂盒说明书.docx

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1、酰基转移酶(alcoholacyltransferase,AAT)活性测定试剂盒说明书微量法100管/96样注意t正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。测定意义:AAT是一个多功能蛋白大家族,主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应,在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。测定原理:AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到醉,释放的COA还原DTNB生成TNB;TNB在412nm有吸收峰,测定412nm吸光度增加速率可计算AAT活性。自备仪器和用品:研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。试剂组成和配制:提取液:液体IOOmLXI瓶

2、,4匕保存:试剂一:液体20mLxl瓶,49保存;试剂二:粉剂Xl瓶,20保存。试剂三:粉剂Xl支,4tC避光保存。粗酶液提取:1 .组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:510的比例(建议称取约0.1g组织,加入ImL提取液)进行冰浴匀浆。8000g,4离心IOmin,取上清置冰上待测。2 .细菌、真菌:按照细胞数量(IO4个):提取液体枳(mL)为5007000:1的比例(建议500万细胞加入ImL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4,离心IOmin,取上清置于冰上待测。3 .液体:直接检测。AAT测定操作:1、分

3、光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到412nm,蒸馅水调零。2、工作液的配制:临用前在试剂二瓶中加入18mL试剂一,充分混匀待用。用不完的试剂分装后20保存,禁止反复冻融。3、试剂三的配制:临用前加无水乙醇ImL充分溶解待用,用不完的试剂49保存。4、空白管:在EP管或96孔板中加入10L提取液和180L工作液,充分混匀,35反应151加,加入10L试剂三,充分混匀,25C静置Iomin,测定412nm处吸光值,记为A空白管。5、测定管:在EP管或96孔板中加入10L样本和180L工作液,充分混匀,35C反应15min,加入10L试剂三,充分混匀,25C静置IOmin,测定412nm处吸

4、光值,记为A测定管。AA=A测定管A空白管,空白管只要做一管。AAT活性计算:a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下(1)按照蛋白浓度计算活性单位定义:每亳克蛋白每分钟催化产生InmoITNB定义为一个酶活单位。AAT(nmol/min/mgprot)=A(EXd)V反总(V样XCPr)T=98.04ACpr(2)按照样本质量计算活性单位定义:每克组织每分钟催化产生InmOlTNB定义为一个酶活单位。AAT(nmol/min/g鲜重)=ZkA+(CXd)XV反总(WxV样V样总)T=98.04xaAW(3)按细胞数量计算活性单位定义:每IO个细胞每分钟催化产生InmolTNB定义为一个酶活单

5、位。AAT(nmolmin104cell)=A(EXd)XV反总(细胞数量XV样V样总)T=98.04xaA细胞数量(4)按液体体积计算活性单位定义:每亳升样品每分钟催化产生InmolTNB定义为一个酶活单位。AAT(nmol/min/mL)=A(:xd)V反总V样T=98.04A8:TNB消光系数,13600Lmolcm:d:比色皿光径:1cm:V反总:反应总体积,0.2mL:V样:加入反应体系中上清液体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL:Cpr:蛋白含量,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,15min。b.使用96孔板测定的计算公式如下(1)按照蛋白浓度计算活性单位定

6、义:每亳克蛋白每分钟催化产生InmolTNB定义为一个酶活单位。AAT(nmol/min/mgprot)=A(EXd)V反总(V样XCPr)T=l96.08ACpr(2)按照样本质量计算活性单位定义:每克组织每分钟催化产生InmOlTNB定义为一个酶活单位。AAT(nmol/min/g鲜重)=ZkA+(xd)XV反总(WxV样V样总)=196.08xaAW(3)按细胞数量计算活性单位定义:每IO。个细胞每分钟催化产生InmolTNB定义为一个酶活单位。AAT(nmol/min/104cell)=A(xd)XV反总(细胞数量XV样V样总)T=196.08xaA+细胞数量(4)按液体体积计算活性单位定义:每亳升样品每分钟催化产生InmOlTNB定义为一个酶活单位。AAT(nmol/min/mL)=A(CXd)V反总V样T=196.08A8:TNB消光系数,l3600Lmolcm:d:96孔板光径:0.5cm:V反总:反应总体积,0.2mL;V样:加入反应体系中上清液体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白含量,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,15min

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