预防及治疗用噬菌体质量标准专家共识.docx

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1、预防及治疗用噬菌体质量标准专家共识摘要日益严重的细菌耐药性给全球公共卫生带来了重大挑战，噬菌体疗法作为细菌感染治疗的替补疗法，近年来重新得到医生、研究者和产业界的重视。噬菌体是特异性感染细菌的一类病毒。噬菌体疗法可以精准靶向并清除病原菌而不破坏自然环境微生态及人体正常菌群。由于噬菌体的活病毒属性、杀菌特异性等特征，使得噬菌体的药学、非临床和临床研究有别于传统药物。目前，国内外尚缺乏相关规范和指南，限制了噬菌体的转化应用和推广。为此，基于国内外前期噬菌体治疗临床研究的经验，并参考噬菌体治疗相关文献报道，组织噬菌体基础研究、临床、药学等领域专家，起草了本共识。对入库噬菌体的来源、噬菌体宿主、入库噬

2、菌体的生物学特性以及入库噬菌体的包装与标识提出要求，旨在规范应用型噬菌体的标准，并满足噬菌体库的共享需求，加速推动噬菌体的研究、转化及应用。关键词：噬菌体；预防及治疗；质量标准：专家共识愈来愈严重的细菌耐药性给全球公共卫生造成r巨大威胁。国家卫生计生委等14部门联合制定了遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)及国家卫生健康委等13部门联合制定了遏制微生物耐药国家行动计划(2022-2025年)。耐药性细菌监测、抗微生物药物合理应用、研发上市全新类型抗微生物药物是国家行动计划的主要目标。噬菌体是一类能特异性感染细菌的病毒。裂解性噬菌体通过吸附、侵入、增殖、装配及彻底裂解细菌释放出大量子

3、代噬菌体从而完成其生命周期，并最终裂解宿主菌。噬菌体疗法是通过裂解性噬菌体靶向裂解病原菌从而治疗细菌性感染。实际上，噬菌体治疗的历史早于抗生素，直至现在噬菌体疗法在格鲁吉亚、波兰等少数国家仍在广泛使用。噬菌体兼具种类多样性和宿主专一性，噬菌体治疗仅靶向清除特定病原菌而不破坏人体正常菌群。因此，在全球细菌耐药口益严重的背景下，噬菌体疗法乂被重新寄予厚望。据统计，截至2021年11月，全球抗菌药物研发中处于一至三期临床试验阶段的和处于临床前阶段的分别有77条和217条,其中噬菌体(及其衍生物)分别为9条和28条。在后抗生素时代，世界各国包括欧洲和美国在内的多个国家均将噬菌体疗法列为应对耐药菌感染的

4、替补策略之一，并不断布局及推进噬菌体治疗的临床应用及转化。噬菌体专一性强、裂解谱窄这一特性在噬菌体治疗及预防应用中是把双刃剑，其优势在于与大多数抗生素相比，噬菌体治疗可以靶向清除病原菌而不破坏正常微生物菌群；劣势在于狭窄的宿主裂解谱限制了其临床使用的匹配性及快速可及性。由于临床感染流行菌株随时间、地域、医院类型等条件的影响而呈高度多样性，选配能裂解.目标病原菌的噬菌体成为成功开展噬菌体临床应用的首要条件，因此需要建立大容量、多样性的噬菌体储备库。虽然国内外已有一些开源的噬菌体库，但总体规模较小，且现有大多数噬菌体库中的噬菌体信息不完整，缺乏相对统一的标准。除了少数主要为研究提供噬菌体的机构，如

5、TCC(https:/www.atcc.org)和NCTC(https:/ww.phe-cu1.turcco1.1.edions.org.uk)等能够提供详细的噬菌体及其宿主菌信息以外，绝大多数噬菌体库并没有提供足够可以共享的信息。国际一些噬菌体研究机构或者公司，如AdaPtiVCPhageTherapeutics(APT)(),TheFe1.ixd,H6re1.IeReferenceCenterforBacteria1.Viruses(https:/WWw.phage,u1.ava1.ca),TheBacteriophageBankofKorea(http:/www.phagebank.or

6、.kr/intro/eng_intro.jsp),1.eibnizInstitute-DSMZ(GermanCo1.1.ectionofMicroorganismsandCe1.1Cu1.tures)(https:/ww.dsmz.de),Hatfu1.1.1.abPhageCo1.1.ection(https:/phagesdb.org或http:/wvw.hatfu1.1.,orgseaphages)等，在公开噬菌体库信息时，大部分只公布了噬菌体与其对应的种属细菌，很少有噬菌体及宿主菌的具体信息。值得一提的是噬菌体目录网站(PhageDirectory,https：/phage,direc

7、tory),该网站通过发布与噬菌体相关的信息，并使噬菌体的需求机构(主要用于治疗)与拥有噬菌体库的机构建立联系，旨在建立一个可以进行噬菌体共享的联络平台。我国也先后成立了上海噬菌体与耐药研究所、国际噬菌体研究中心、国际噬菌体药物研究中心、中英噬菌体工程联合实验室和国际噬菌体协同创新中心等多个噬菌体研究中心或研发机构，但绝大多数亦未公布其拥有噬菌体的具体信息。为了能够更好地服务于噬菌体治疗及预防使用，满足噬菌体研究的科研需求、实现噬菌体资源共享，由中国噬菌体研窕联盟、中国微生物学会医学微生物学与免疫学专业委员会和中国生物工程学会噬菌体技术专业委员会共同组织噬菌体基础研究、临床、药学等领域专家，对

8、噬菌体的来源、宿主、生物学特性（形态、复制能力、PH值稳定性、温度稳定性、基因组特征）及入库噬菌体的包装与标识等提出建议，旨在形成共识，推进噬菌体治疗的临床应用及转化。1 入库噬菌体的来源1.1 天然噬菌体据估计，生物圈中有1031数量级的噬菌体颗粒，广泛分布于人们生活周围的土壤、水体、空气、动植物、饮用水、食品等环境中。目前很多噬菌体库中的噬菌体均为从自然环境中分离的噬菌体。利用已知的宿主菌从自然环境分离得到的噬菌体均为天然噬菌体，天然噬菌体的具体分离纯化方法见附件】（天然噬菌体分离纯化流程）及相关参考文献13,15。入库用天然噬菌体要注明分离地域、分离时间、分离环境、宿主菌的来源、季节等信

9、息。1.2 基因工程噬菌体使用基因工程和合成生物学技术人工改造或合成噬菌体，可以使噬菌体的性能更加优良。理论上，基因工程噬菌体可以解决天然噬菌体宿主谱窄、难以分离、易产生抗性等应用中遇到的瓶颈问题。入库的基因工程噬菌体应提供以下相关信息：（1）相关专利：（2）不具备相关专利时，如为合成噬菌体，应有详细的合成路径及基因组信息：如为改造噬菌体，应标识改造的具体序列信息或任何形式公开过的改造后的基因或片段信息及具体位点：（3）表观遗传修饰等其他修饰及改造信息；（4）是否对外源基因片段及相关改造进行生物风险评估。2 噬菌体宿主2.1 分离噬菌体所用宿主菌自然界中噬菌体的生存及繁殖均依赖于宿主菌，因此从

10、污水、土壤、粪便等环境样本中分离天然噬菌体时通常会使用一株甚至多株宿主菌。分离用宿主菌应具备种属、分离来源、分离时间、分离地区等信息。如果为全基因组序列已知菌株，应对基因组携带的毒力基因、耐药基因及前噬菌体序列信息进行汇总列表。2.2 扩增噬菌体所用宿主菌由于噬菌体具有严格的宿主专一性，且临床分离菌株与标准菌株或者工程菌株差异较大，很难使用一种或几种标准菌株或工程菌株对所有噬菌体库中的噬菌体进行扩增。因此，扩增噬菌体用宿主菌的选取应从扩增噬菌体的有效性、专一性、遗传稳定性及培养条件方面考虑，优先选用标准菌株或工程菌株；若不是标准菌株或工程菌株，犷增噬菌体用宿主菌除应具备种属、分离来源、分离时间

11、、分离地区等信息外，还需要基因组序列已知且基因组中不含可诱导的前噬菌体、基因组中质粒及其他可移动遗传元件较少、携带较少耐药基因、致病性较弱、噬菌体感染及扩增效率高等条件，并提供扩增噬菌体时细菌培养的最适培养基成分及培养条件。2.3 噬菌体宿主谱从F1.然界分离纯化的噬菌体，有些裂解的宿主范围很窄，而有些则很宽。为了能够及时高效地共享噬菌体资源，入库的噬菌体应进行裂解谱分析，且尽可能提供裂解谱中菌株的详细信息，包括种属、分离来源、分离时间、分离地区等。3 入库噬菌体的生物学特性3.1 噬菌体形态不同形态的噬菌体对外界条件（如环境、温度、离子成分）及体内环境的耐受性往往也有差别，对不同场兔的应用效

12、果亦可能有影响。目前经透射电镜得到的噬菌体形态照片超过5OOO个，多数为有尾噬菌体，多型体和丝状噬菌体仅有大约190个。入库噬菌体应有经透射电镜观察后得到的可分辨的、高清晰的结构照片，以便于使用者了解或预判其稔定性等信息。3.2 噬菌体复制效力噬菌体作为一类感染细菌的病毒，无法在宿主体外完成独立繁殖,需要成功感染宿主后利用宿主的细胞组分实现增殖。入库噬菌体应包含噬菌体的最适宿主及其在最适宿主中的一步生长曲线，以方便使用者掌握噬菌体的扩增效力。3.3 噬菌体对温度的稳定性温度条件是进行噬菌体存储及运输时最大的影响因素，应对入库噬菌体在49、室温、低温（W-80、干冰或者液施）条件下，至少长至半年

13、时间内滴度变化进行标识。3.4 噬菌体对PH值的稳定性在环境或者临床治疗应用时，pH值往往波动较大，入库噬菌体应标识其在酸性(PHS4)、碱性(pH210)及pH=7时的稳定性，以保证使用过程中噬菌体的有效活性。3.5 噬菌体的基因组特征噬菌体可以在细菌中长期传代繁殖并产生大量子代噬菌体，但在繁殖过程中噬菌体的基因组有发生突变的可能。入库的噬菌体应挑取单个噬菌斑纯化三次后再进行测序，经测序后的噬菌体应基于多个数据库进行基因组注释分析，标示详细的基因组信息，包括核酸类型、基因组大小、编码基因数量、基因注释、毒力基因、耐药基因、整合酶基因、tRNA基因及假定的其他特殊类型基因等。4 入库噬菌体的包

14、装与标识取噬菌体及最适宿主通过规定的方式传代不多于IO次，传代次数多于10次应重新进行测序分析。在同一传代水F,将同次培养物均匀地混合成一批，定量分装，噬菌体的滴度建议210,pfum1.,并于4C、冻干或-80C等不同条件下平行保存，每次制备样品为独立批次。每个入库噬菌体应建立详细的质量控制信息表，内容包括噬菌体编号及扩增宿主菌编号、宿主谱、培养基及培养条件、噬菌体分离环境样本类型(天然分离噬菌体)、地理位置、形态、基因组测序数据路径、滴度、保藏溶液、PH值稳定性、制备口期、制备实验室、保藏位置、保存温度、保质期限、提供者信息、保藏人等信息(表1)。由于噬菌体基因组具有整合到细菌基因组或与细

15、菌基因组进行遗传交换的潜在风险，因此临床治疗使用的噬菌体基因组中还不能携带溶源相关基因、毒力及耐药基因。表1入库噬菌体标识信息样表项目噬菌体扩增宿主种属宿主谱-培养基及培养条件-环境来源地理位置形态-基因组序列文件路径滴度-保藏溶液PH值稳定性-制备日期制备实验室保藏位置保存温度保质期限提供者信息保藏人附件1天然噬菌体分离纯化流程1 噬菌体的分离纯化(1)经伦理批准的多重耐药细菌菌株，纯化鉴定后挑取单菌落接种于5注培养基，放置最适培养温度，摇床震荡或静止培养过夜。(2)将培养过夜的培养液按照1：50的比例接种至5m1.培养基中,培养至对数期OQ0.60.8)(3)根据细菌的生境及流行病学特征，

16、从自然环境中取土壤样本并充分溶于SM缓冲液(NaC1.5.8g1.,MgSO,7H02g1.,明胶0.1g1.,Tris-HC1.pH7.0、50mmo1.1.).污水(如医院来源、生活污水)等环境样本，于600Og转速离心Iomin,取上清并经0.45Um滤膜过滤。(4)取等体积培养至对数期的菌液和过滤上清，并加入1/3体积的3义培养基，混合均匀后培养过夜。(5)取培养过夜的混合液，于8000g转速、4条件下离心，收集上清并经0.45m滤膜过滤。(6)取12m1.经高压含0.5%琼脂的培养基，冷却至4555C,取2001.过滤液、800H1.培养至生长期的细菌培养液和8m1.0.7%琼脂培养基混合，混匀后迅