中药指纹图谱建立的原则和步骤.docx

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1、(一)建立指纹图谱的一般原则中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分探讨和药理学探讨为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。唯此，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。1.系统性是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂件类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂甘类成分：银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采纳两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。2 .特征性是指指纹图谱中反映的化学信息(如保留时间)应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区

2、分中药的真伪与优劣，成为中药H身的化学条码。如北五味子的HP1.C指纹图谱和T1.C指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有很多未知类成分，这些成分的峰位依次、比值在肯定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区分其来源、产地，判别药材的真伪优劣。3 .稳定性是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同试验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和好用性。因而要求包括样品制备、分析方法、试验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。（二）建立指纹图谱的一般步骤1

3、.方案设计与思路（1）探讨对象的确定在调研有关文献、新药申报资料（质量部分和工艺部分）及其它探讨结果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的探讨对象，即分析检测目标。例如，黄英含黄酮、皂苗及多糖三类有效组分，黄苗多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为探讨对象，黄黄原药材的指纹图谱应把黄丽、电昔及多糖作为探讨对象。复方注射剂应依据君臣佐使的原则，以君药、臣药中的有效成分作为指纹图谱的探讨对象，佐使药中的成分可采纳其它指纹图谱方法进行协助、补充探讨。（2）探讨方法的选择探讨方法应依据探讨对象的

4、物理化学性质来选择。大多数化合物可采纳HP1.C例如黄芭中黄酮、皂甘、多糖等。挥发性成分应采纳GCo例如鱼腥草中的鱼腥草素、土木香中的土木香内酯、异土木香内脂和二氢土木香内酯等。某些有机酸经甲酯化后亦可用GC分析。采纳上述方法难以分别检测的成分，可考虑运用T1.C和CEo一个中药制剂的指纹图谱可以同时采纳多种方法进行探讨。选择方法时，还需考虑药品检验系统复核时的设备、技术等因素。(3)探讨内容依据国家食品药品监督管理局中药注射剂指纹图谱探讨的技术要求(暂行)的规定，主要探讨内容有原药材、中间体、注射剂的指纹图谱，涉及样品名称、来源、制备、测定方法、指纹图谱及技术参数等。2 .样品的收集这是最初

5、也是最关键的步骤。至少要收集10个批次样品。留意样品的代表性。(1)切不行将同一批次样品分散成数个批次，充当样品。(2)原药材尽可能固定产地(GAP基地药材，地道药材)、采收期和炮制方法。对光线稳定，疗效稳定，无临床不良反应的药材批次应重点选择。(3)中间体、注射剂样品的收集应重点选择工艺稳定、疗效稳定、无不良反应的批次。(4)留样应不少于试验用量的3倍，3 .供试品溶液的制备(样品的预处理)1）药材供试液的制备依据所含成分的理化性质，通过溶剂提取、液液萃取、沉淀、吸附等方法，分别宫集样品.例如，黄芭中黄酮类成分通过碱的萃取、皂昔类通过大孔吸附树脂吸附：苦参中总生物碱通过阳离子交换树脂分别：挥

6、发性样品常用水蒸气蒸谣法制备。样品富集后，还需通过氧化铝预柱、C18预柱、硅胶预柱、聚酰胺预柱等，除去色素等杂质，最终通过微孔滤膜，供HP1.C测试。（2）中间体供试液制备可针对有效成分处理，并参照原药材的制备方法。（3）注射剂供试液制备液体注射剂一般无需特别处理，可干脆分析检测。4 .参照物的选择一般选取样品中倚单获得且含量较高的一个主要活性成分或指标成分作为参照物（三）。参照物主要用于指纹图谱技术参数的确定.如特征峰（共有峰）的相对保留时间，峰面积比值等。并有助于图谱的稳定性、重现性的考查。例如三七药材的指纹图谱中以三七皂甘R1.为参照物。由于指纹图谱比较困难，内标物不易选择、插入，故一般

7、不以内标物做为参照物。5 .试验方法和条件的选择其目的是通过比较试验，从中选取相对简便易行的方法和条件，获得足以代表品种特征的指纹图谱，以满意指纹图谱的专属性、重现性和普遍适用性的要求。方法和条件须经过严格的方法学考察。例如稳定性试验，精密度试验，重现性试验等。留意事项：供试液的制备和色谱分析时均须定量操作，以保证图谱在整体特征上进行半定量(差异程度或相像程度)的比较。指纹图谱分析不同于含量测定,提高其分别度应以不牺牲色谱的整体特征为前提，故不应孤立地苛求分别度达到含量测定的要求。采纳HP1.C和GC制定指纹图谱，记录时间一般为1小时。(实测2小时)6 .比照指纹图谱及其技术参数的建立(1)测

8、得的大量色谱数据需经分析和数据处理，才能获得比照指纹图谱(拟合指纹图谱)及其技术参数,以此作为药品指纹图谱检验的依据。(2)技术参数主要包括总峰面积、共有峰序号、参照峰(三)、共有峰相对保留时间(RRT),共有峰峰面积比(RA),非共峰面积等。RRT=RTiRTsRA=AiAs共有峰亦称特征峰(包括参照峰)，系指全部被检批次中均含有的相同色谱峰，主要来源于样品中主要有效成分或指标成分。共有峰的化学归属，可采纳比照品加入法或HP1.C/DAD/MS/MS联用技术进行鉴别，后者可在无比照品的状况下运用。例红方丹参注射液指纹图谱应有9个特征峰相对保留时间/分钟(峰序号)：0.145(1)0.186(

9、2)0.298(3)0.378(4)0.425(5)0.499(6)0.594(7)1.Ooo(S原儿茶醛)1.145(8)峰面积比值：0.059(1)0.064(2)0.036(3)0.11230%(4)0.054(5)0.29725%(6)0.055(7)1.OOO(S原儿茶醛)0.040(8)7 .药材、中间体和注射剂指纹图谱的相关性注射剂中各特征峰均可在药材及中间体指纹图谱中得到追踪，中间体与注射剂的指纹图谱应特别接近，药材图谱中的色谱峰应比注射剂多。必要时可采纳加入某一药材、有效部位或中间体的供试品，或制备某一药材、有效部位或中间体阴性供试品的方法，标定各指纹图谱之间的相关性。供应相关性探讨的指纹图谱.8 .指纹图谱的评价中药指纹图谱的评价系指将样品指纹图谱与建立起来的比照指纹图谱进行相像性比较，从而对药品质量进行评价和限制.中药指纹图谱的评价不同于含量测定，它强调的是相像性(SimiIarity),而不是相同性(Identity),也即着重辨识完整图谱面貌,而不是求索细枝末节。分析比较的结果是对供试品与比照品之间的差异或一样性作出的评价。相像性的比较可以用相像度表达，相像度可借助国家药典委员会举荐的中药指纹图谱计算机协助相像度评价软件“计算，一般状况下相像度在0.9-1.0之间即认为符合要求。