人透明质酸HAELISA试剂盒.docx

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1、人透明质酸(HA)E1.ISA试剂盒本试剂仅供研究使用试验原理：HA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(E1.ISA).已知HA浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将HA生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B1和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中HA的活性浓度呈比例关系。试剂盒内容及其配制试剂盒成份(2-8C。保存)96孔配置48孔配置配制96/48份酶标板1块板(96T)半块板(48T)即用型塑料膜板盖1块半块即用型标准品：400ngml1瓶空白对照1瓶(1.0ml)标准品稀释缓冲

2、液1瓶生物素标记的HA抗体1瓶(0.6ml)1瓶(0.3ml)按说明书进行稀稀1瓶(0.5ml)即用型(5ml)1瓶(2.5ml)即用型(6ml)1瓶(3.0ml)即用型亲和链酶素-HRP1瓶(IOmI)1瓶(5.0ml)即用型洗涤缓冲液1瓶(20ml)底物A1瓶(6.0ml)底物B1瓶(6.0ml)终止液1瓶(6.0ml)1瓶(IOmI)按说明书进行稀释1瓶(3.0ml)即用型1瓶(3.0ml)即用型1瓶(3.0ml)即用型自备材料1 .蒸储水。2 .加样器:53、IOuk50uk100uk200、5003、100OuI03 .振荡器及磁力搅拌器等。安全性1 .避免直接接触终止液和底物A、B

3、o一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。2 .实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。3 .不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。人透明质酸(HA)E1.ISA试剂盒操作注意事项1 .试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。2 .实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。3 .不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。4 .使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。5 .使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。6 .洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶

4、标反应孔中吸水。7 .底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。8 .加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。9 .按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。人透明质酸（HA）E1.ISA试剂盒样品收集、处理及保存方法1、血清操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。2、 血浆EDTA,柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。100OXg离心30分钟去除颗粒。3、 细胞上清液-100OXg离心10分钟去除颗粒和聚合物。4、

5、保存如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70C。保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37Co或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。试剂的准备1.标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：400ngml（6号标准品）200ngml（5号标准品）100ngml（4号标准品）原倍浓度不用稀释直接加入50ulo100uI的原倍标准品加入100Ul的标准品稀释液100uI的5号标准品加入100Ul的标准品稀释液50ngml（3号标准品）100Ul的4号标准品加入1

6、00Ul的标准品稀释液25ngml（2号标准品）100Ul的3号标准品加入100Ul的标准品稀释液12.5ngml（1号标准品）100Ul的2号标准品加入100Ul的标准品稀释液0ngml（空白对照）原始浓度不用稀释直接加入503。2.洗涤缓冲液（50）的稀释：蒸储水50倍稀释。人透明质酸（HA）E1.ISA试剂盒操作步骤1 .使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。2 .根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。3 .加入稀释好后的标准品50ul

7、于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37C。温育1小时。4 .甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。5 .每孔加入80Ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀，37C。温育30分钟。6 .甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。7 .每孔加入底物A、B各503,轻轻振荡混匀，37C。温育10分钟。避免光照。8 .取出酶标板，迅速加入503终止液，加入终止液后应立即测定结果。9 .在450nm波长处测定各孔的OD值。性能1 .灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。2 .特异性：不与人其它细胞因子反应。3 .重复性：板内、板间变异系数均小于10%。4 .局限性：6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。结果判断与分析1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值2、以吸光度C）D值为纵坐标（Y）,相应的HA标准品浓度为横坐标（X）,做得相应的曲线,样品的HA含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。3、检测值范围：0-400ngml4、敏感度：1.0ngml