禽白血病综述及PCR技术探讨.ppt

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1、 禽白血病流行病学及防控禽白血病流行病学及防控1荧光荧光PCR检测技术及应用检测技术及应用2POCKIT现场现场PCR检验系统检验系统3核酸自动提取仪的应用核酸自动提取仪的应用4禽白血病毒（ALV）是一种反转录病毒，类似于人的艾滋病毒。传播方式：垂直传播、横向感染、昆虫、针头、活疫苗污染。ALV分类（亚群）：A，B，C，D，E，J，K。近两年J亚群在临床上的分离率较高。净化鸡群，主要指的是净化外源性病毒。所谓外源性病毒，是指不会通过染色体传递的ALV，主要包括A、B、J亚型，这些亚型的病毒致病力较强。禽白血病禽白血病囊膜糖蛋白（gp85）它是区别亚群的抗原。常见的A、B和J亚群ALV感染后的鸡

2、，可用对应的抗体检测试剂盒检测选。主要衣壳蛋白（群特异性抗原，p27）不同亚型间区别不明显，它可用来初步检测ALV，如ELISA检测。但无法区别致病性外源性病毒和无致病性内源性病毒。ALV的主要抗原蛋白鸡群的临床和病理表现 生长迟缓、产蛋下降、不同脏器组织的肿瘤、腺胃炎、腺胃肿大、骨硬化等。肿瘤性死亡：最主要的危害。1.ALV的A、B、C、D亚群主要引起淋巴细胞瘤为主，有时可见血管瘤。2.ALV的J亚群主要引起髓样细胞瘤。生产性能下降：其中对蛋鸡危害最大。免疫抑制：免疫后抗体效价低。ALV的危害 严格控制种源不定期监控和检疫进口种鸡监控本地种鸡群的感染状态本地品系鸡原种鸡群的净化 种鸡场ALV

3、检测方法1.采取刚出壳雏鸡胎粪或肛拭子做p27检测。2.开产初期（25周龄）做2-3次采血，接种Df1细胞，培养9天。应用p27抗原ELISA试剂盒+间接免疫荧光方法联合检测病毒。3.种蛋蛋清做p27检测。4.SPF鸡胚中卵黄抗体检测，卵黄抗体基本可代表血清抗体状态。检测种鸡所产种蛋中p27抗原阳性率。1.必须保证检测的蛋样100只。2.需在开产及高峰，孵化前采集。3.阳性率1%即为高风险。不合格。4.样品抽取的随机性。ALV感染风险评估体系1.血清学检测l优点：方法简单、可大量操作。l缺点：无法鉴别诊断，有时会与E亚群交叉反应。l用途：流调、净化状态判定、SPF鸡群的感染情况l试剂盒选用：I

4、DEXX2.ALV-p27抗原检测l优点：方法简单、可大量操作。l缺点：无法区别内源外源病毒，会导致假阳性。l用途：出壳雏鸡肛拭子检测。l试剂盒：IDEXX、中监所。ALV检测方法2.3.核酸检测法用PCR（RT-PCR）结合特异性核酸探针做分子杂交，直接检测样品中有无A、B、J群的病毒核酸。优点：直接检测病毒，灵敏度高，特性性高。缺点：操作人员需要有一定的操作基础，无法得到病毒。如何选用适合的检测试剂盒？l用不同滴度的抗原盲测，选出最敏感的。l同一品牌不同批次的试剂盒进行筛选。ALV检测方法1、灵敏度高荧光PCR由机器检测扩增物，最少可检出0.1ng扩增产物。普通PCR结果由肉眼检测，至少需

5、要100ng产物才能判定结果。2、人为污染小荧光PCR无需开盖，全程使用仪器运作，PCR结束即可得到结果，避免气溶胶污染造成的假阳性。普通PCR需要打开PCR管盖，取出产物进行电泳，容易污染。3、效率高，可相对定量避免电泳和溴化乙锭染色，生物安全度高，荧光PCR仪出结果速度也更快。另外可以进行定量分析。荧光PCR的优点阈值设定原则阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。结果描述及判定阳性对照CT值30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无CT值并且无特定扩增曲线，视为有效结果。30CT35并出现特异曲线，需要重新做。若结果仍为可疑，可判定阳性。CT值35时，

6、超过本方法范围，视为阴性。对于某些未呈现S曲线，但本底较高的样品，视为阴性。荧光PCR检测结果条件设置（元亨）分为两类产品1、禽病诊断试剂盒禽流感试剂盒：通用型、H5亚型、H7亚型、H9亚型。新城疫诊断试剂盒。2、猪病诊断试剂盒口蹄疫通用型、蓝耳病通用型、高致病性蓝耳病、猪瘟、猪圆环2型、伪狂犬试剂盒。chanpin 1、便携性高2、操作简单3、反应时间短4、灵敏度高5、投入成本低POKITPOKIT传统传统PCRPCR操作时间1.5小时3-5小时设备所需空间办公室或者简易实验室较大的独立空间PCR产物污染问题无风险较高人员素质需求看说明书即可操作需具备分子生物学知识导致巨大差别的导致巨大差别

7、的因素因素导致一般差别导致一般差别的因素的因素样品采集、储存采集部位、保存液、冻融样品量核酸抽提交叉污染、抑制剂、病毒裂解样品量、回收率核酸定量检测引物设计、模板质控仪器、循环条件核酸测序引物设计仪器滤膜法滤膜固定 核酸被动洗脱，抑制剂难以去除干净，回收率、重复性较差。固体污染物残留滤膜上难以自动化 膜堵塞、交叉污染、真空。磁珠法磁珠法磁珠法磁珠分散于溶液中 核酸主动洗脱，抑制剂去除彻底 回收率稍高、重复性更好固体污染物被清除很容易自动化适用于不同的样品：DNA、RNA、蛋白。样品处理通量1-32，96孔板，处理体积20-1000uL。免去传统手工提取操作，最大程度避免污染。快捷、自动化提取，提取质量高，重复性好。扩展接口：USB，以太网口，支持网络接入。操作界面：全中文大屏幕7寸彩色液晶+触控操作。根据不同试验要求编辑程序，控制温度，运行操作，还具备试验后紫外灯杀菌功能。自设快捷方式。支持U盘拷贝数据结果。触控式操作触控式操作触控式操作