最新：液相色谱－质谱临床应用建议.docx

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1、最新：液相色谱-质谱临床应用建议液相色谱-质谱(LC-MS)技术在临床诊断治疗领域的应用日益广泛为了使LC-MS技术在临床诊疗中规范应用，中华医学会检验医学分会、卫生计生委临床检验中心共同制定液相色谱-质谱临床应用建议，并由复旦大学附属中山医院检验科执笔起草，广泛征求相关领域检验专家的意见。本应用建议最后经中华医学会检验医学分会和卫生计生委临床检验中心组织专家进行讨论修改后，由中华医学会检验医学分会、卫生计生委临床检验中心和中华检验医学杂志编辑部共同发布。由于医学科学技术发展迅速，本应用建议将适时修订，以适应医学发展和临床应用的需要。引言1.C-MS是一种联合液相色谱和质谱分析的检测技术，结合

2、了色谱对物质的高分离能力和质谱对物质结构和质量的分析能力，具有高选择性、高特异性以及高灵敏度的特点。与免疫方法相比，LC-MS更适合用于小分子化合物的定性、定量检测(如激素、药物及其代谢产物、维生素、氨基酸等)。1.C-MS不仅在临床检测中发挥优势，更有助于开发临床检测项目的参考方法。随着易用性和自动化程度不断提高，LC-MS会成为临床检验技术重要的一部分。本应用建议旨在为定量LC-MS方法的临床检测提供基本指导原则，主要包括两部分：LC-MS检测的基本要求和LC-MS方法的建立、验证和执行。第一部分LC-MS临床检测的基本要求一、实验室基本要求（一）实验室环境要求实验室应根据不同仪器厂商的要

3、求，提供足够的工作空间，建议预留出仪器和辅助设备装载空间以及操作和数据处理工作空间。实验室应确保质谱仪的两侧有足够的空间放置色谱仪和废液瓶。机械泵建议装载于仪器附近下方并高于地面，周围留有足够的空间便于散热和保养维修。仪器四周应留出适当空间便于日常操作、定期维护保养和检修。仪器不适于直接安装于空调下方或阳光直射处。仪器安装应符合安全操作要求。实验室应确保仪器在充分通风、温湿度严格控制的环境下运行。仪器附近应避免存在干扰检测的震动、磁场和射频辐射源。若实验室无中心供气设备，还需要预留出供气瓶空间或气体发生器的空间和废气排放管路并符合安全操作要求。为保证仪器检测性能的稳定和可靠，建议使用具有稳压的

4、连续不间断电源,安装要求应参照各个仪器的具体参数。除了仪器基本的配置外，实验室还需配置储存样品及标准品的冰箱或冷库及样品前处理工作区域。实验室建议使用MS级去离子水要求的纯水制备仪或直接购买MS级别的纯水以供使用。建议1实验室环境需根据LC-MS仪器厂商的具体安装要求，提供足够的工作空间，严格控制温湿度，供气、供电以及供水符合要求等，进行科学规划、装修和调整。（二）实验室安全要求依据中华人民共和国卫生行业标准-临床实验室安全准则、中华人民共和国国家标准实验室生物安全通用要求和危险化学品安全管理条例等相关文件，实验室应制定适当的安全防护措施1。实验室操作人员在实验区内需穿着遮盖前身的长袖隔离服或

5、长袖长身的工作服，佩戴手套，必要时佩戴其他防护装备伎口护目镜、帽子或面罩等）。为保证操作人员安全，生物样本处理需要在二级生物标准实验室或通风橱操作进行。实验室必须安装安全冲淋设施和洗眼器。化学危险品应贴有成分标签，按照说明要求按类储存，双人双锁。常用的易燃有机溶剂应保存于箱柜内，氮气或其他气体瓶要有固定装置以防倾倒泄漏。化学危险品的申购、领取、保存、使用和处理需做好相应记录。应依据医疗废物管理条例、医疗卫生机构医疗废物管理办法等法规，结合各实验室的实际情况，制定对操作过程中产生的气体、液体和固体危险废弃物的收集、存放和处理的细则，做好气体排泄的安全工作。为保证实验室安全，建议定期对实验室进行安

6、全检查。建议2实验室需按照国家、地方颁布的法规或条例，制定全面、适用的安全防护规章制度，保证人员、环境和标本的安全。应有气体、液体和固体危险废弃物的收集、存放和处理实施细则，制定化学危险品试剂存储和使用要求，做好人员防护工作。（三）人员要求实验室主任应确保开发和使用的检测系统提供了保证质量的实验室服务,确保实验室具备完善的设备设施和环境条件以及符合生物安全法规要求。实验室主任对操作人员进行规范化操作教育和培训I。建议配备生物化学、分析化学或临床检验等相关教育背景和工作经历的研发人员和经过培训的操作人员。操作人员在上岗前，需经系统性的理论和操作培训，并通过相应的技能考核，证明具备与工作相关的理论

7、知识和操作能力。初学人员，建议在有经验人员的指导下完成相关操作。实验室制定操作人员培训计划，包括实验室内部及外部培训I。培训记录证明相应实验操作人员通过培训考核。实验室建立每一位操作人员的档案记录，包括员工的简历、教育背景、工作经验、培训考评记录等。建议3实验室主任应确保实验室检测性能良好、设备环境完善、生物安全合规以及人员培训、操作规范。研发人员应具备生物化学、分析化学或检验医学等相关的教育背景和工作经历。操作人员应经培训、考核后才能上岗操作。二、仪器设备1.C-MS检测系统由LC、进样接口、离子源、质量分析器、检测器、数据处理器等组成。其中定量分析多用三重四级杆、离子阱、飞行时间质量分析器

8、。选择LC-MS系统时应综合考虑预期工作用途、检测灵敏度、分析通量、稳定性以及系统成本等因素2。LC1.C是基于混合物中不同分析物在固定相和流动相间分配平衡的分离技术。高效液相色谱技术有极高的分离性能和良好的重现性等特点，常作为质谱搭配使用的首选。（二漓子源目前临床质谱仪常用的三种离子源分别为ESLAPCI和APPIz其特征如表2所示。表2:三种临床常用质谱离子源的特点（三）质量分析器质量分析器是质谱仪的重要组成部件，位于离子源和检测器之间，依据带电离子质荷比（mz）检测分析物。常见的质量分析器包括四极杆质量分析器、飞行时间质量分析器、离子阱质量分析器和混合串联质量分析器。单四极杆质谱仪内置有

9、质量分析器，该分析器只能测定仪器离子源中形成的离子，可提供的结构信息较为有限。串联四极杆（有时称为三重四极杆）质谱仪内有两个被碰撞室分开的四极杆质量分析器。质量分析器检测模式包括全扫描、子离子扫描、母离子扫描、中性丢失扫描以及MRM等。三重四极杆质量分析器是临床定量检测最为常用的质量分析器。建议4选择LC-MS系统时应综合考虑分析类型、检测灵敏度、分析通量、稳定性以及成本等因素。三、分析前准备（一）样本采集、运输和储存1 .样本类型：目标分析物在体内存在的形式决定了检测选取的样本类型。临床常见的样本类型包括全血、血清、血浆、尿液及唾液等，例如对易结合于红细胞内的分析物（如环抱素A、他克莫司、西

10、罗莫司等），推荐采用全血样本检测；在毒理学检测中常用尿液样本。2 .采血体位：需考虑某些血液成分的检测结果易受到采血体位的影响，例如检测某些血压相关激素及其代谢产物（醛固酮、儿茶酚胺等）时，采血体位变化易导致结果的差异，需根据体位建立相应的参考区间。3 .采集：对外源性和内源性分析物，都要考虑采集时间。治疗药物、毒物、补充剂等外源性化合物，应根据其药物代谢动力学特性选择恰当的采集时间，例如在治疗药物监测中，环抱素A、他克莫司等药物的峰值或给药前浓度能反映药物在体内水平，而服用1,4-丁二醇二甲磺酸酯、霉酚酸患者需检测多点药物浓度，通过药物曲线下面积确定给药策略。激素等内源性化合物水平随生理周期

11、、性别和年龄而发生规律性变化，如孕酮等存在生理周期变化、皮质醇等具有昼夜节律变化等，应根据激素的变化规律选择采集时间。应考虑样本采集的设备和容器对检测的影响，例如在样本采集过程中使用了不恰当的采样针可能导致血细胞破碎，引起溶血，影响检测结果。4 .运输：对样本在运输过程中的全程监控也很重要，避免运输不当造成对检测的影响。5 .分析前处理：导致化合物不稳定的因素主要有物理因素和化学因素。物理因素包括光照和温度，化学因素与分析物的化学结构有关。正确的样本处理方式有利于保证生物样本稳定性。分析前样本的稳定性对生物分析数据有效具有重要意义。建议5应充分考虑样本类型、采血体位、采集、运输、处理、储存等因

12、素对检测结果的影响。（二）IS的选择IS指不同于目标分析物的已知质量的纯品物质,主要用于LC-MS定量分析中校正基质效应或样本萃取、色谱分离、离子化过程中产生的偏差3,有利于提高定量分析的准确性和精密度及方法稳定性。IS应选择不存在样本中的非内源性物质,应具有与目标分析物相似的理化特征和相似的色谱保留时间,应避免IS中存在与目标分析物在色谱中可以共同洗脱且具有相同质量数的干扰物，其浓度不能干扰分析物的LLMI的检测。IS一般有两种，即结构类似物和稳定同位素标记物。目标分析物和结构类似物IS之间不应发生质谱峰重叠现象。推荐使用非放射性稳定同位素标记物，因其具有不易转化为非标记物质的特点，并能满足

13、作为IS的稳定性及安全性的要求，使分析结果具有更好的精密度和准确性。检测中建议IS的相对分子质量比目标分析物至少大3,标记纯度超过98%3o目前,商品化同位素标记的IS包括2H、13C、15N、180或混合标记，不推荐使用放射性较强的标记，如1251、3H和14C;推荐使用13C、15N标记。IS的浓度会影响LC-MS的线性、精密度和准确性,其浓度的选择要适当。IS的加入顺序十分重要。一般推荐IS在处理前加入样本中，以校正样品前处理过程中分析物的损失；对于需预酶解的样本，如果IS是酶解后目标化合物的类似物，建议在酶解后掺入。由于内源性物质干扰，标准曲线所用的基质和样本有差异时,同位素IS应该作

14、为第一选择用于校正不同基质分析物离子化的差异。在检测分析过程中，应监测IS响应波动的程度。建议6推荐采用稳定非放射性标记物作为IS,选择适当的浓度和加入顺序，并监测IS响应波动的程度。（三）试剂和耗材准备1.C-MS技术灵敏度高，可达到皮克级，故容易受到试剂纯度或耗材杂质的干扰，需关注检测过程中试剂和耗材对检测的影响。1 .试剂准备：试剂中的杂质会导致离子抑制，影响检测结果，因此有机试剂的纯度选择极为重要，需要评估该试剂是否会产生离子抑制。建议挑选MS级别的试剂，使用前需做好验证工作，使用期间按照说明书恰当保存，操作过程必须避免污染，防止高温和挥发对其稳定性、浓度和纯度的影响。2 .耗材的选择

15、:样本采集和预处理过程中，样本采集管、塑料吸头、离心管和微量滴定板等耗材内析出的杂质会影响分析物检测结果，产生干扰峰或背景噪音，例如有报道表明，普通的血清分离管的杂质会影响睾酮检测结果，某些聚丙烯离心管对25-羟基维生素D检测结果也会产生影响。同一厂商的不同批次的耗材，因生产流程或材料来源改变，也可能干扰最终的检测结果。新色谱柱及管路在使用前建议适当平衡以去除制造过程中残留的杂质。在标准品和IS制备时，实验室需配备A级的容量瓶和移液器。使用前需评估和记录容量瓶、移液器的准确性和精密度4。建议记录样本制备使用的试剂、色谱柱以及其他耗材的批号，以便追溯干扰源。建议7关注检测过程中试剂和耗材对检测结

16、果的影响，记录每个试剂、色谱柱、耗材的批号以便追溯干扰源。四、质量控制1.C-MS的实验室质量管理体系包括质量保证和质量控制，必须涉及整个检测流程，即从预处理、样本检测到结果解释。完善的质量管理体系有利于保证检测系统的稳定性和可靠性。为监测每个操作步骤，应要求质控品与样本的操作步骤基本一致。质控品的选择需注意基质与检测样本相似、稳定且均一。（一）室内质控1 .浓度范围：建议尽量检测3个浓度质控样本。质控样本浓度尽可能覆盖定量范围，包括三倍LLMIx定量范围的中间以及ULMI的附近，也可设定在LLMI或者医学决定水平附近。2 .质控频率：建议在每批次检测前、后均运行质控样本。质控频率取决于方法学性能、某一时间段内检测的样本数量以及错误结