SPATA48基因SNPrs998928的多态性与少精症的相关性研究.docx

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1、SPATA48基因SNPrs998928的多态性与少精症的相关性研究目录中文题目、摘要、关键词1英文题目、摘要、关键词21前言32材料与方法43结果64讨论75结论7参考文献8总结与体会10谢辞11SPATA48基因SNPrs998928的多态性与少精症的相关性研究摘要目的：初步探究睾丸特异性基因SPernIatogenCSiS-associated48(SPATA48)基因的单核甘酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)rs998928,探讨SPT48基因SNPrS998928与男性少精症的相关性。方法：利用SNaPShOt分型技术对206例少精症患者和1

2、90例正常男性的样本SPT48基因SNPrs998928多态性位点进行分型。结果：与正常组相比，少精症组C频率升高(758%vs75.5%,2=0.1,P=092LOR=O.921,95%CI=0.735-1.407),差异不显著(P0.05),无统计学意义；少精症组纯合子CC基因型频率降低(57.4%vs56.3%,X2=O,045,P=O.832,OR=I.044,95%CI=0.701-1.555),杂合子CT基因型频率升高(36.8%vs38.3%,X2=O.096,P=O.757,OR=O.938,95%CI=0.624-1.409)；纯合子TT频率升高(5.8%vs6.3%,X2=

3、O.038,P=0.8450R=l.089,95%CI=0.461-2.574),三种基因型在俩组中相比差异不显著(P0.05),无统计学意义。结论：SPATA48基因rs998928位点的多态性可能与少精症不相关。关键词SPATA48基因；单核甘酸多态性；男性不育；少精症AssociatinbetweenPolymorphismsofSNPrs998928inSPATA48GeneandOligospermiaAbstractObjective:TopreliminarilyexploretesticularspecificitygeneSpermatogenesis-associated4

4、8(SPATA48)SingleNucleotidePolymorphism,SNP)rs998928JnvestigatathecorrelationbetweenSPATA48geneSNPrs998928andmaleoligospermia.MethodsiCollectedthe206patientswithOligozoospermiaand190normalreproductivemenascontrolsgenepolumorphismbySNaPshottechnology.ResuIts:Comparedwiththenormalgroup,Intheoligospermi

5、agroup,thefrequencyofCgenewasincreased(75.8%vs75.5%,X2=0.1,P=0.921,OR=0.921,95%CI=0.735-1.407),withnosignificantdifferenceandnostatisticalSignificanceJntheoligospermiagroup,thehomozygousCCgenotypefrequencyintheoligospermiagroupwasslightlylower(57.4%vs56.3%,X2=0.045,P=0.832,OR=1.044,95%CI=0.701-1.555

6、),andtheheterozygousCTgenotypefrequencywashigher(36.8%vs38.3%,X2=0.096,P=0.757,OR=0.938,95%CI=0.624-1.409),ThefrequencyofhomozygousTTgenotypeswashigher(5.8%vs6.3%,X2=0.038,P=0.845OR=1.089,95%CI=0.461-2.574),andthedifferencesofthethreegenotypeswerenotsignificant(P0.05).ConclusionjThepolymorphismofSPA

7、TA48SNPrs998928maybeunrelatedtooligospermia.KeywordsSpermatogenesis-associated48gene；Single-Nucleotide-Polymorphism；OligoSpermia;maleinfertility.1前言根据世界卫生组织的统计资料,不孕不育症占育龄夫妇的20%左右,其中男性因素导致不孕不育约占50%u随着社会工业化程度的提高和生活节奏的加快，再加上环境污染和不良生活习惯等因素，男性精液质量日趋下降，无精子症，少精子症和弱精子症等男性不育患者人数逐年上升，男性生殖健康的问题越来越受到全社会的关注。而男性精

8、子生成是一个复杂而精确的规制过程，精原干细胞必须进行精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂、染色质浓缩、精子特异性蛋白的产生、精子细胞对精子的圆形至长的转化以及一系列额外的复杂过程，最终导致附生精子的形成。这些人类独有的生理现象需要经过连续的睾丸特异性基因在一定时间内有秩序地激活。因此，深入研究睾丸特异性基因，不仅可以揭示精子发生过程的分子机制，还可以探讨男性不育的遗传基础。STlS数据库分析，发现了一些新的睾丸特异性基因，包括SPATA481。SPATA48隶属于SPATA家族，该家族成员主要在睾丸组织中特异表达，但是关于SPATA48的表达模式还未有相关文献报道”叼。研究发现SPATA48基因

9、在人的睾丸组织中特异性高表达，但在人其他组织如心脏，肺，脑，肾，肝，脾，胰腺，附睾中未表达;在小鼠睾丸组织中特异性表达，但在小鼠其他组织如心脏，肺，脑，肾脏，肝脏，胰腺，脾脏，结肠，附睾，胃等11种组织中均不表达1;SPATA48基因在人类、小鼠，黑猩猩中都存在同源蛋白，但这些蛋白质没有相同的结构域I，其功能尚不清楚。近年来，通过免疫组化研究人类SPATA48蛋白在正常生育者睾丸活检样本和非梗阻性无精子症患者睾丸活检样本发现，正常生育者睾丸中SPATA48蛋白主要分布在精母细胞和圆形精子细胞中,SPATA48蛋白在生精细胞中的表达可能是阶段依赖性的；在非梗阻性无精子症患者睾丸中的SPATA48

10、蛋白表达消失这说明SPATA48对于精子发生必不可少。SPATA48基因的异常表达可能会导致是导致无精症的原因。通过对小鼠和人类同源基因比较分析后，发现小鼠体内有相应的同源基因SPATA48“。SPATA48基因在小鼠睾丸中是有时间依赖性的，在成年时期很高，SPATA48基因在成年小鼠的睾丸组织中扮演着重要的角色.最近的基因敲除鼠的研究表明许多基因与无精子症有关，其机制也在逐渐阐明，在无精子症的小鼠睾丸中，该基因敲除后，小鼠睾丸小，精子发生缺陷。SPATA48基因在小鼠和人类精子生成是必不可少的，缺乏SPATA48基因的男性生育功能将会严重受损，导致小睾丸和精子缺陷spat48对于小鼠和人类的

11、精子生成是必不可少的。缺乏spat48-男性生育能力的损害，导致小睾丸和缺陷的SPer-胎生小鼠。与睾丸特异性相关的基因有CKT2,NAN0S2l5j,GRTH/DDX25,SePtin12，Gsk3-,Ddrlt93,TESP-ll0,Prmltl11,Tnpl,2,Seppl,3,MEIGIt*43,SPATAI6冈等，这些基因在精子发生过程中起着重要的调控作用，突变或缺失会导致严重的不育症。最近的基因敲除鼠的研究表明许多基因与无精子症有关，其机制也在逐渐阐明。STIS数据库分析,发现了一些新的睾丸特异性基因，包括SPATA48，在成人睾丸中SPATA48基因得到了高度表达和筛选。在通过对

12、小鼠和人类同源基因比较分析后，发现小鼠体内有相应的同源基因SPATA48u7同时SPATA48基因在人和小鼠体内随着年龄的增加而变化。SPATA48基因在小鼠睾丸中是有时间依赖性的，在成年时期很高，SPATA48基因在成年小鼠的睾丸组织中扮演着重要的角色“外在无精子症的睾丸中，该基因敲除后，小鼠睾丸小，精子发生缺陷，表明SPATA48在小鼠精子发生中起重要作用此外，还有研究发现SPATA48基因在人的睾丸组织中特异性高表达，但在人其他组织如心脏，肺，脑，肾，肝，脾，胰腺，附睾中未表达;在小鼠睾丸组织中特异性表达，但在小鼠其他组织如心脏，肺，脑，肾脏，肝脏，胰腺，脾脏，结肠，附睾，胃等11种组织

13、中均不表达另外，还发现SPATA48基因不是在血清细胞、精原细胞中表达，而是在精母细胞中表达。在精子和成熟精子中发现了SPATA48基因的转录物。所以SPATA48基因在小鼠和人类精子生成是必不可少的，缺乏SPATA48基因的男性生育功能将会严重受损，导致小睾丸和精子缺陷。本课题通过利用SNaPshot技术（微测序技术），在正常男性和少精症男性中对SPATA48基因SNPrs998928进行检测，初步探讨其多态性与男性少精症之间的相关性，从而对男性不育遗传病因学提供一定的参考资料。2.材料与方法1 .1研究对象本研究病例组共206例少精症患者，所有患者都按照世界卫生组织的标准做过俩次或更多次精

14、液检测，年龄在24至40岁之间，不包括患有影响精子正常发育疾病的情况,如睾丸生精功能阻滞，精索静脉曲张，以及输精管阻塞，泌尿生殖系统感染等；此外还利用相应的分子手段排除了梗阻性无精症，Y染色体异常和其长臂上AFZ区的基因微缺失，激素水平异常的情况。实验的对照组为190例正常男性，年龄在24岁至40岁之间，他们至少育有一子，没有辅助性的预防技术。如体外受精，胞腔内精子注射，胞腔内形态选择精子注射。所有研究对象之间均无亲缘关系。参与此次研究的样本由附属医院提供，本人均已知情同意。2 .2实验试剂血液基因组DNA提取试剂盒-离心柱型（北京天根生物科技有限公司）DNALadder（北京天根生物科技有限

15、公司）PCR引物（安徽通用生物系统有限公司合成）Taq酶（加拿大FennentaS公司）dNTP（加拿大Fermentas公司）ExoI酶（加拿大FernIentaS公司）FastAP酶（加拿大FCnnentaS公司）Snapshot试剂盒（美国ABl公司）2.3实验仪器和设备东胜龙黑金刚EDC-810PCR仪（中国北京东胜创新生物科技有限公司）3730XL基因测序仪（美国ABI公司）Allegra25R台式高速冷冻离心机（美国贝克曼公司）Micro17R微量台式离心机（美国赛默公司）微量可调移液器（德国Eppendorf公司）2.4实验方法2.4.1DNA的提取及检测用DNA提取试剂盒（离心

16、柱形）对研究者的外周血按试剂盒操作流程进行全基因组DNA提取，DNA提取完成后1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，浓度检测后，皆标准化至1017ngl,-80保存备用。2.4.2PCR扩增引物的设计及延伸引物的设计设计PCR引物，引物由安徽通用生物系统有限公司合成。引物名称是rs998928,其上游引物为GGTCATCnCGGAnCTC,下游引物为TCTTGCCGTTCGG.延伸引物为TTTTTTTTTTTTTCCTGTGGTGGGGTCGCGG,方向为R（后随链），延伸引物长度为22,延伸产物为CT。2.4.3PCR扩增其反应体系为DNAIul;10*buffer1.5ul;MgCL2（25mmol）1.5ul;DNTP（IOmniol）O.3u