单细胞转录组测序技术在动物上的应用研究.docx

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1、单细胞转录组测序技术在动物上的应用研究熊和丽沙茜刘韶娜相德才张斌赵智勇（云南省畜牧兽医科学院，昆明650024）细胞是机体最基本功能单位，细胞类型和功能由其表达的RNA决定,同一个体细胞的基因组基本相同，但每种细胞类型甚至每个细胞表达的RNA具有唯一性1L普通以同质组织或是同类细胞为整体进行的转录组测序，其基因表达是整个组织所有细胞的平均水平，掩盖了细胞的独特性及异质性，并且在研究复杂生物学机制过程中，目标细胞的表达特征可能被组织其他大量细胞所掩盖。传统细胞的分类往往基于细胞结构、功能、位置或是有限的细胞标记，而不是系统性和综合性的指标，并且由于细胞处于不断变化过程中，导致难以区分细胞类型和细

2、胞状态，稀有细胞更无从鉴定2,而单细胞转录组测序通过对单个细胞的所有转录本进行测序，可以依据单个细胞的表达谱特征以高精度分辨率鉴定细胞类型和细胞状态，并且可以鉴定稀有细胞,锁定目标细胞以进行深入分析，是解析目标表型背后复杂分子细胞机制的有力工具。单细胞转录组测序不仅在方法上是对传统细胞鉴定与分类技术的突破，在功能上也将大力促进细胞生物学的发展。1单细胞转录组测序技术简介单细胞转录组测序技术是对单细胞的mRNA进行测序的技术。单细胞转录组测序得益于高通量测序技术的发展，2022年，Tang等3通过对单个细胞mRNA测序方法的改进，检测到小鼠囊胚单细胞中的5270个基因，其基因数量远高于利用微阵列

3、对数百个囊胚细胞的测序数据，首次实现了单个细胞的InRNA高通量检测，从此开启了单细胞转录组测序时代。随着单细胞转录组测序技术的不断发展，单细胞转录组测序技术也从细胞类样本延展到组织样本，测序通量由单个细胞增加到上万个细胞。至今，单细胞转录组测序技术已有十余种，但其操作步骤基本都包括单细胞的分离，单细胞转录组文库构建及测序。1. 1单细胞的分离从细胞或组织样本中分离单个细胞是单细胞转录组测序的第一步，单细胞的分离应快速、准确以获得高质量的单细胞4。单细胞的分离首先需要制备单细胞悬液，制备细胞悬液的样本主要是培养的细胞或各种组织。培养细胞通过机械吹打或酶解的方法制成细胞悬液，组织样品经过剪碎为小

4、块再利用酶进行消化制备细胞悬液。由于不同细胞、组织特性的差异，酶的选择及消化时间有所不同，需要摸索出最佳消化条件以获得高活性及完整性的细胞。制备的单细胞悬液根据样品特点可以采用以下几种方法分离为单个细胞进行后续的操作，分别是荧光激活流式分选(fluorescentactivatedcellsorting,FACS)、微流控装置(IniCrofIUidiCdevices)微量移液(micro-PiPetting)以及激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection,LCM)5oFACS具有高通量、低成本、自动化以及高效率的特点，还可根据细胞标记筛选目标细胞，但其要求至少上

5、万的细胞起始量，不适合用于细胞数量少及珍贵的细胞样品，并且分选压力可能造成细胞破坏；微流控装置利用微流控孔道将细胞分离到微滴或微孔中，可对微量样品进行处理，通量高，操作可标准化自动化，并且分选成本低，分选过程对细胞造成的破坏小，但微流控孔道对细胞体积大小有一定限制，可能会造成体积大的细胞被丢失，商业化的平台IOXGenomics是利用微滴，而BDRhapsody是利用微孔的细胞捕获方法L5-7；微量移液利用毛细玻璃管在显微镜下从单细胞悬液或组织中分离单个细胞，操作耗时，通量低，但在显微镜下操作可以保证单个细胞的分离及选择高质量的细胞，适用于细胞数量少或是脆弱的细胞，如早期胚胎细胞，骨髓微环境细

6、胞5-6；LCM利用激光从组织切片上分离单个目的细胞，其优点是保留了细胞原有的空间位置信息，组织无需酶解，但组织切片的制作可能造成直径大于切片厚度的细胞丢失或破坏，并且通量低，耗时耗力，对设备要求高5,8o1.2单细胞转录组文库构建及测序目前的高通量测序平台只能对DNA分子进行测序，因此单细胞转录组测序中mRNA需要先反转录为CDNA后再进行扩增测序Q由于单个细胞总RNA含量为皮克级，其中mRNA约仅占总RNA的2%-5乐而高通量测序建库要求纳克级DNA,因此需要将起始的cDNA扩增数十万倍才能构建文库L9o分离的单细胞经过细胞裂解后利用OIigo(dT)引物对带有PoIy（八）尾的mRNA进

7、行反转录后扩增，以此避免rRNA和tRNA的干扰，但同时也无法检测不带POIy（八）尾的各种RNAQ目前常用的单细胞转录组扩增方法有PCR法和体外转录线性扩增9。利用PCR法的单细胞转录组测序技术如Smart-SeqSmart-Seq2,IOXChromium,Drop-seq,SCRB-seq,Seq-Well以及sci-RNA-seq,利用体外转录线性扩增的技术如CEL-seq2C1,inDrops,MARS-SeqLlO-IlLcDNA扩增过程中PCR偏好是单细胞转录组测序中基因表达定量的重要影响因素，通过对每条转录本添加一段6-10bp的随机序列（UniqUemoleculariden

8、tifiers,UMD来为每条转录本引入特定标记，一段UMl对应一条转录本，无论PCR循环多少次，UMl数量不变，以此进行基因表达定量，解决了CDNA的扩增偏好，如CEL-seq,Drop-seq,MARS-seq等方法10,但由于引入标记在3,端或5端，不能测序全长HiRNA,因此适用于对基因表达进行定量，不适用于可变剪切的分析。而扩增全长mRNA的方法如SnIart-seqSmart-seq2,通过双端引物扩增，避免了3或5偏好，但仍存在PCR偏好，然而全长InRNA可用于转录本解释、等位基因表达及可变剪切分析6,10。扩增的CDNA随后被片段化并加上接头序列进行测序Q另外，文库构建过程中

9、通过对每个细胞引入barcode,可以将多个细胞乃至多个样本混合测序，从而实现单细胞转录组测序的高通量，如10Chromium,Drop-seq,SCRB-seq,Seq-Well等方法，而不采用细胞barcode的单细胞转录组测序技术如Smart-SeqSmart-seq2,一次只能测序一个细胞，适合细胞稀少的样本如干细胞、胚胎细胞或目标细胞的单细胞转录组测序。至今，已有超过10种单细胞转录组测序技术被研究报道11,各种技术的文库构建方法不同，其测序表现也存在一定差异，Ziegenhain等通过从灵敏度、准确性、测序细胞数及测序成本等几个方面系统比较6种方法(CEL-Seq2/C1、DroP

10、-seq、MARS-Seq、SCRB-seqSmart-Seq/Cl、Smart-seq2)的测序表现，研究发现Smart-seq2检测到单个细胞和总细胞的基因数最多，具有最佳的灵敏性，其次是SCRB-seqsSmart-seq/CKCEL-seq2Cl,而DrOP-Seq和MARS-seq单个细胞的基因数减少了近50%；CEL-seq2C1、Drop-seq.MARS-seq、SCRB-seq由于引入UMIs具有较低的扩增噪音；当细胞数量较大时，Drop-seq具有最好的测序成本优势，而MARS-Seq、SCRB-seq和Smart-Seq2在测序少量细胞时具有成本优势10。Ding等对两种

11、低通量(SnIarLseq2和CEL-seq)和5种高通量(IOXChromium,Drop-seq,Seq-Well,inDrops以及sci-RNA-seq)方法的系统比较,发现Smart-seq2和CEL-seq具有最佳灵敏度，而5种高通量方法中的10Chromium检测到的单个细胞的基因数最多；DrOP-Seq,Seq-Well,inDrops测序成本最低，Smart-seq2测序成本最高11。综合来看，当样品细胞数量大，研究以鉴定细胞类型和稀有细胞为目的，Drop-seq是较适合的单细胞转录组测序方法，若样品细胞数量少，研究目的是转录组解释，检测遗传变异及发现新的转录本亚型，SnIa

12、rt-seq2是比较好的选择10T1。另外，测序细胞数和测序深度是单细胞转录组测序实验设计需要考虑的重要参数。由于单细胞转录组测序细胞数受到细胞亚群多样性，稀有细胞的比率及测序方法的影响，因此很难估计准确的测序细胞数,目前对肿瘤细胞的测序数估计方法是利用公式P(d)=1-(l-s)n,其中P(d)表示检测力，s代表亚克隆频率，n代表测序细胞数量。依据公式，当目的细胞的比率为1%时，测序250个细胞能达到0.9的检测力，而测序500个细胞达到1.0的检测力12。Ziegenhain等1.10通过对CEL-Seq2C1、Dropseq、MARS-seq、SCRB-seq、Smart-seq/C1、

13、Smartseq2六种方法的测序深度与敏感性关系进行研究，发现单个样本测序reads达1millionreads时，测序灵敏性逐渐稳定,当测序reads从1million增加到4.5million时，测序灵敏性没有明显改变。Pollen等研究发现若以细胞分类和稀有细胞的鉴定为研究目的，建议单个细胞测序50000J100000reads13,而Smart-seq2单细胞测序达到约1millionreads时利于后续等位基因表达及可变剪切分析14。2单细胞转录组测序的生物学应用单细胞转录组测序通过单个细胞高精度的转录表达谱对细胞类型及细胞状态进行鉴定，发现细胞间差异及变化，分析细胞动态变化过程以及

14、细胞间互作关系，鉴别正常细胞与异常细胞等。2. 1细胞类型鉴定细胞类型的鉴定是深入认识细胞功能的先决条件，而单细胞转录组测序最基础和最重要的应用就是细胞类型的鉴定。17世纪罗伯特胡克在显微镜下首次发现细胞以来，人们对细胞的表征描述及分类的准确度已经大大提高，但人们对细胞的分类多基于细胞形态、功能、位置及有限的分子标记，而非基于系统性或综合性的指标，因此，到目前人们对细胞类型、状态的描述及数量的认识仍非常有限2,15。细胞类型决定于细胞的转录表达谱1,16,单细胞转录组测序通过获得单个细胞基因表达谱，为细胞类型的鉴定提供了高精度系统性的方法。2022年，浙江大学郭国骥教授团队发表了利用微孔板单细

15、胞转录组测序技术对人体60种组织样品和7种细胞培养物进行单细胞转录组测序研究结果，研究鉴定了人体100余种细胞大类和800余种细胞亚类，远远多于传统认为人体细胞约有300种细胞类型的数量2,17-18。哺乳动物神经系统由数以万计到数十亿计的神经元组成，并且具有多种功能，通过单细胞转录组测序发现，即使微升级的大脑组织拥有成千上万种不同类型细胞，甚至传统认为同质的细胞，其细胞也表现出很大的异质性，单细胞转录组测序为复杂神经系统神经元分类提供了强大工具12,1612022年10月人类细胞图谱计划启动，其基本目标是采用特定的分子表达谱来确定人体的所有细胞类型，并与经典的细胞空间位置和形态的描述连接起来

16、，最终建立综合性的人类细胞参考图谱，以促进生命科学、疾病诊断、监测以及疾病精准治疗的研究。细胞图谱构建的关键环节是细胞类型的鉴定，因此单细胞转录组测序在人类细胞图谱计划中发挥着巨大的驱动作用。2022年，Han等17绘制了首个人类全细胞图谱，图谱涵盖胚胎和成年期八大系统的细胞，包括100余种细胞大类和800余种细胞亚类。随着科研人员的大量投入及单细胞转录组测序技术不断发展，目前与人和模式动物相关的多个细胞图谱构建出来。研究发育相关的细胞图谱，如人青春期睾丸发育的动态转录组细胞图谱19、小鼠小脑胚胎8个发育阶段及出生后4个时期绘制小鼠小脑发育细胞图谱20；研究免疫器官的细胞图谱，如人胸腺发育细胞图谱21、斑马鱼淋巴细胞在组织稳态期和免疫攻击后淋巴细胞的综合图谱22、乳腺癌微环境中免疫细胞图谱23。2022年，Han等24利用微孔板单细胞转录组测序技术对小鼠近50种