大豆抗原蛋白诱发五指山小型仔猪过敏反应的实验研究.docx

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1、大豆蛋白glycinin和conglycinin经口诱发五指山小型猪过敏反应的实验研究黄琼I徐海滨基金项目：国家科技部973计划(NO:2007CB 109207)通讯作者简介：徐海滨，男，研究员，博士生导师，研究方向：食品毒理学，转基因食品安全性评价， E-mail： hbxu 1231602(3)I广东省疾病预防控制中心2中国疾病预防控制中心营养与食品安全所2杨杏芬I黄俊明I于州2高苑2刘珊2广东省疾病预防控制中心毒理实验所，广州510300摘要：目的建立适用于评价食物中潜在致敏物质的五指山小型猪大豆球蛋白(IlS)和B伴球蛋白(7S)经口致敏模型。方法20头1.5月龄五指山小型猪分别摄入

2、含0%、4%US、8%11S4%7S、S%7S大豆蛋白的饲料，通过胃肠道致敏(O-IOd)和反笈经口激发(16T8d,31d)诱导致敏反应，从皮肤试敏反应、血清TgG.IgE和组胺水平、小肠组胺含量和肥大细胞数量、外周血淋巴细胞亚群和细胞因子表达等方面进行模型评价和可能致敏机制的探讨。结果接受IIS或7S经口致敏的仔猪皮肤试敏试验呈不同程度的阳性反应；致敏组仔猪血清中TgGTgE抗体和组胺含量在第19d即激发期后达到最高，三个时间点仔猪血清中IgG、IgE抗体和组胺含量两两呈正相关；实验第19d4%IlS和4%7S致敏组血清中IgG、IgE抗体和组胺含量均高于对照组，第32d4%IlS和4%7

3、S致敏组IgE抗体和4%IlS致敏组IgG抗体和组胺含量均高于对照组；空肠组胺含量与十二指肠组胺、同肠组胺含量呈正相关，而与空肠粘膜层和粘膜下层肥大细胞数呈负相关；4%7S致敏组空肠组胺高于对照组，4%IIS致敏组空肠粘膜下层肥大细胞数目低于对照组；实验第19d4%7S致敏组血清中IFN-含量较对照组降低；实验终期8%IlS致敏组外周血CD4+CD8+比值较对照组升高，以上差异比较或相关性检验均有显著性意义(P0.05或0.01)。结论由大豆蛋白glycinin和B-Conglycinin诱发的五指山小型猪食物致敏模型属IgE介导的I型过敏反应类型，可用于食物潜在致敏性的评价。关键词：食物过敏

4、大豆球蛋白大豆伴球蛋白五指山小型猪ExperimentalstudiesofanaphylacticreactionsinWZSminipigorallyinducedbysoybeanglycininand-conglycininHUANGQiong,XUHaibin9YangXingfen,HuangJunming,YuZhou,GAOPeng,LiuShanInstituteofToxicology,CenterforDiseaseControlandPreventionofGuangdongProvince,Guangzhou510300,ChinaAbstract:Objective

5、:Toestablishglycinin(IlS)and-conglycinin(7S)allergyminipigmodelstoevaluatepotentialallergensinfood.Methods：Twenty1.5monthsoldWZSminipigswererespectivelygastricSensitized(O-IOd)andoralchallenged(16-18d,31d)withdietscontaining0%,4%US,8%11S,4%7Sor8%7Ssoybeanproteinstoinduceanaphylacticreactions.Skinpri

6、cktest,serumIgG,IgEandhistaminelevels,smallintestinehistamineconcentrationsandmastcel1numbers,bloodlymphocytesub-setsandcytokinesexpressionsweremeasuredtoevaluatethemodelandinvestigatepossiblemechanisms.Results:Positiveskintestresponsesatdifferentdegreeswereobservedin1ISand7Ssensitizedgroups.Theseru

7、mIgG,TgEandhistaminelevelsallreachedthepeakafterIlSor7Sgroupswereoralchallengedat19d,andeverytwoofthemweresignificantlyandpositivelycorrelated(P0.01).Comparedwiththecontrol,serumIgG,IgEandhistaminelevelsof4%HSand4%7Sgroupsat19d,serumIgEof4%IlSand4%7Sat32d,andserumIgGandhistaminelevelsof4%HSat32dwere

8、allsignificantlyincreased(P0.05or0.01).Thejejunumhistaminelevelwaspositivelycorrelatedwiththatoftheduodenumandileum,butnegativelycorrelatedwiththemastcellnumbersinthejejunummucosaandsub-mucosa(P0.01).Comparedwiththecontrol,thejejunumhistaminelevelof4%7Sgroupwasincreasedandthemastcellnumberinthejejun

9、umsub-mucosaof4%1ISgroupwasdecreased(P0.05or0.01).Comparedwiththecontrol,theserumIFN-contentof4%7Sgroupwassignificantlydecreased,whiletheCD47CD8*ratioof8%HSgroupwassignificantlyincreased.Conclusion:TheWZSminipigallergymodelinducedbysoybeanglycininand-conglycininbotharetypeIhypersensitivitymediatedby

10、IgE,whichcanbeusedtopredictthepotentialallergenicityofnovelfoods.Keywords:FoodAllergyglycinin-conglycininWZSminipig食物过敏是指食物引起的一类非毒性不良反应，主要临床表现为皮肤、胃肠道或呼吸道症状，严重者可导致全身系统性过敏症状如休克等甚至死亡。目前估计全世界范围内有3%4%的成年人和6%的儿童患有食物过敏,因此食物过敏已成为国际社会关注的一个食品安全问题1。而且，食物过敏流行趋势仍在继续增长，尤其是在“西方化”社会，原因可能与“卫生假说”和全球范围内食物消费多样性的增加相关2。已

11、知的常见食物致敏原包括大豆、花生、甲壳类动物、鸡蛋、牛奶、鱼、坚果和小麦等。目前对于食物过敏反应的治疗尚无十分有效手段，个体预防性回避接触确认或可疑致敏原仍然是防治关键。除上述传统的八大类食物致敏原外，食物中潜在致敏物质的评价也是预防的关键。随着基因工程技术的迅猛发展，转基因食品的出现不仅带来了新一轮的食品工业革命，同时也掀起了关于其安全性的质疑热潮，关于其潜在致敏性的评价从一开始就是人们关注的热点。1996年NOrdIee报道了转入巴西坚果基因后的大豆可诱发对巴西坚果过敏的人发生过敏反应3,此案例在一定程度上促进了致敏性鉴定成为转基因食品安全性评价中必不可少的重要内容。目前，关于转基因食品致

12、敏性评价通常采用综合、逐步及个案分析的原则4,常用的分析方法为1996年国际食品生物技术委员会(IFBC)和国际生命科学学会(ILSD联合制订的判定树分析法（decisiontreeapproach）5,该方法包括结构分析和氨基酸序列比较；理化特性研究如消化稳定性和热稳定性；蛋白质在食物中的含量及消费模式等。2001年,FAO/WHO在该判定树的基础上进行了发展和完善,主要增加了靶血清筛选试验和动物模型试验内容,并认为食物致敏动物模型是评价其潜在致敏性最直接的方法,再次肯定了开展食物致敏动物模型研究的必要性和意义6。研究至今，食物致敏动物模型主要用于验证过敏性疾病的免疫治疗物质有效性和预测对人

13、类有潜在致敏性的物质两方面。动物种属涵盖啮齿类动物和非啮齿类动物，前者主要是小鼠、大鼠和豚鼠，后者包括狗、猪等。目前国际上尚未建立食物致敏性评价的标准动物模型，实际上任何单一模型不可能适用所有目的，至今也未发现一种可重复23种以上常见食物致敏原在人体引起的过敏反应的动物模型，关键是要根据研究目的和各种模型特点进行针对性地选择7。比如啮齿类动物模型多适用于分子和细胞水平的致敏机制研究，并具有费用少、易获得和易操作的优势。而在进行过敏性疾病研究，如更多关注皮肤、呼吸道和胃肠道等临床症状的改变则可考虑使用大动物如猪和狗等作为模型。近年来，一些非啮齿类大动物如猪和狗等，由于诸多优势逐渐被食物致敏研究者

14、们关注和利用：（1）确认的对天然过敏食物的临床和免疫学表现；（2）与人类更近似的解剖学、生理学和营养需要特点；（3）与人类更近似的免疫病理学、机制学和治疗性干预策略；（4）可反复多次胃肠道内窥镜观察；（5）可获得大量免疫器官或细胞进行研究；（6）可减少单位体重致敏原使用浓度。当然这些大动物研究的一些缺点也是易见的，主要集中在种属与品系的有限性，基因敲除品系尚不可得，免疫方法研究试剂的缺乏，大体积而小样本以及较为昂贵的费用等方面8。与其它动物模型比较，猪在研究致敏原发病机理和免疫应答等方面有许多更重要的优点。除与人类在胃肠道生理学和黏膜免疫发育上的极相似性外，同时由于具有先天免疫反应活性使得利用

15、猪进行免疫反应评价更为有效和可能。目前进行猪的致敏模型研究只在个别实验室开展9T0,利用猪致敏模型筛选转基因食品的潜在致敏性尚未见研究报道。大豆作为一种优质植物性蛋白原料，已被广泛应用食品和动物饲料生产中，但由于其含有的多种抗营养成分影响了其进一步的开发和利用。大豆抗原蛋白是大豆中最主要的抗营养因子，而大豆球蛋白（glycinin）和-伴球蛋白（-conglycinin）是两种免疫原性最强的大豆抗原蛋白，诸多研究对两者的免疫血特性和致敏性作了广泛研究，现已明确这两种蛋白是引起动物大豆过敏反应的主要物质11。本研究以我国自主驯化和成功培育的实验用近交系五指山小型猪作为模式动物，采用大豆抗原蛋白g

16、lycinin和onglycinin作为阳性致敏物，建立适用于评价食物中潜在致敏物质致敏性的大动物模型，旨在为我国建立转基因食品致敏性的评价程序提供一定理论依据和实验参考。1材料与方法1.1 大豆抗原蛋白纯化的大豆提取物glycinin（以下简称IIS）和。-CongIyCinin（以下简称7S）蛋白由中国农业大学食品科技学院郭顺堂教授惠赠（专利号为：No200410029589.4）,冷冻干燥磨粉后4C冷藏保存，经SDS-PAGE电泳和考马斯亮兰染色后分析，纯度分别为85%和80%。1.2 动物和饲料20头（4窝义5头）五指山小型猪仔猪由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供，仔猪30d时开始逐步进食无大豆配方饲料，45d完全断乳进入全封闭式猪舍，舍温2628C,相对湿度为5070%,昼夜光照交替时间为1212h,送排风为集中自动控制，仔猪单笼(70CmX60CIn)饲养，不锈