形态学与流式细胞术联合检测嵌合抗原受体-T细胞方法探究.docx

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1、形态学与流式细胞术联合检测嵌合抗原受体-T细胞方法探究嵌合抗原受体(ChimeriCantigenreceptor,CAR)-T细胞免疫治疗现在已经成为治疗血液疾病的重要治疗技术，并且在临床治疗中取得了较好的效果1,2,3,4oCAR-T细胞在患者体内的存在和扩增与其临床反应密切相关5o尤其是CAR-T细胞免疫治疗主要并发症，细胞因子释放综合征与CAR-T细胞在体内的扩增相一致6o所以建立一种可靠的检测方法来追踪CAR-T细胞的数量及变化,不仅有助于观察治疗的效果，而且对于患者的安全也尤为重要。目前检测CAR-T细胞的方法主要有实时荧光定量PCR1.7(real-timequantitativ

2、ePCR,Q-PCR)与流式细胞术8,9,10,11o其中Q-PCR的灵敏度最高，特异性最强。但是每种方法都有其局限性，譬如Q-PCR只能得到拷贝数，而无法看到细胞的表型。流式细胞术会面临抗体特异性不佳等问题。形态学作为一种快速、简洁有效的血液标本检测方法，目前尚未见形态学检测CAR-T细胞的报道。本研究通过分析CAR-T细胞与正常淋巴细胞区别，确定CAR-T细胞的形态学特征。但是仍然存在部分标本不能准确区分CAR-T细胞与形态相似T/NK淋巴细胞和淋巴瘤细胞。针对以上问题，我们探究形态学与流式细胞术联合检测的方法，弥补单种检测方法的不足，以期达到快速，准确定量检测患者体内CAR-T细胞的存在

3、及变化。资料与方法一、材料回顾性分析自2016年8月至2021年8月在徐州医科大学附属医院血液科接受CAR-T细胞免疫治疗256例患者外周血与骨髓中形态学与流式细胞术检测CAR-T细胞的结果。256例患者均为CAR-T细胞输注后生存期超过1个月。其中多发性骨髓瘤患者118例，急性淋巴细胞白血病患者68例，淋巴瘤患者70例。分别统计CAR-T细胞输注后第7天、第15天和第21天患者外周血CART细胞数量。分别统计多发性骨髓瘤患者及急性淋巴细胞白血病患者于CAR-T细胞输注后第15天骨髓中CAR-T细胞数量。本研究通过徐州医科大学伦理委员会审批(XYFY2016-K1.0103-01;XYFY20

4、17-K1.013-01),所有患者均签署知情同意书。二、仪器与试剂显微镜O1.YMPUSBX43,Navios流式细胞仪购自美国BeckmanCOlIlter公司。Biotin-Protein1.GenSCriPt用磷酸盐缓冲液重悬为浓度1mg/ml保存于4C。AlexaFluor647-conjugatedStreptavidin美国JaCkSOnImmunoResearchIaboratories公司，红细胞裂解液和相关抗体均购自美国BectonDiCkinSOn公司。三、方法1 .标本采集：经CAR-T细胞输注治疗后患者，分别于第7、15和21天采集外周血，并于第15天采集骨髓标本，进

5、行CAR-T细胞检测。2 .取外周血及骨髓涂片，经瑞氏染色后，观察患者血片及骨髓片CAR-T细胞与正常T淋巴细胞形态学差异，分析CAR-T细胞形态学特征及数量比例。3 .通过流式细胞术检测蛋白1.分析CAR-T细胞在骨髓或外周血中的含量。提取样本单个核细胞并进行计数，调整浓度至1义107个/ml。取600I标本，平均分成3管，用3ml冰冷1X磷酸盐缓冲液洗涤3次(含有4%牛血清白蛋白)，离心后，重悬到0.2ml每管，分别标记为A、B、C3管。首先，A、B管只加设门抗体(CD3Percp.CD4FITC.CD8PE、CD45V500),C管加设门抗体与1g蛋白1.,4避光孵育45min,3ml冰

6、冷磷酸盐缓冲液洗涤3次。离心弃上清后，BC管加入10IAlexaFluor647-共相链霉亲和素，4C避光孵育30min,3ml冰冷磷酸盐缓冲液洗涤3次。离心弃上清后，重悬为0.2ml,上机检测。至少获取IXIo6个细胞11。四、统计学分析所有数据经整理后以统计学软件SPSS20.0软件进行统计学分析,通过形态学分析患者外周血或骨髓中CAR-T细胞,并统计检出率。通过流式细胞术分析患者外周血或骨髓中CAR-T细胞，并统计检出率。采用X2检验比较2种方法联合分析与单种方法分析检出率的差异。以P0.05为差异有统计学意义。结果一、形态学分析CAR-T细胞结果通过形态学方法分析256例患者外周血或骨

7、髓CAR-T细胞检出226例，检出率88.28%。CAR-T细胞在骨髓中形态学表现为：胞体较正常淋巴细胞体积大，圆形，类圆形；胞浆嗜碱性，边缘易见一至多个数量不等的伪足凸起，部分细胞胞浆内可见细小颗粒；核圆形，核浆比大，核染色质为成熟结构（图1A）o外周血中CAR-T细胞胞体较正常成熟淋巴细胞大，胞体圆形，类圆形；胞浆量丰富，胞浆内易见颗粒，核圆形，类圆形，不规则形，染色质均匀一致，核仁未见。形态较骨髓相比，伪足减少，体积略大，胞浆内颗粒增多，细胞核变得略不规则，但核膜依然圆润。部分胞浆凸起的细胞形态介于单核样异型淋巴细胞与大颗粒淋巴细胞之间，较单核样异型淋巴细胞相比没有胞浆边缘深蓝，较大颗粒

8、淋巴细胞相比体积偏大，核略不规则（图IB）o图1嵌合抗原受体T细胞在骨髓与外周血中的形态特征（瑞氏染色，油镜X1OoO;IA为骨髓嵌合抗原受体T细胞，胞体较正常淋巴细胞体积大，圆形，类圆形；胞浆嗜碱性，边缘易见一至多个数量不等的伪足凸起，部分细胞胞浆内可见细小颗粒；核圆形，核浆比大，核染色质为成熟结构；1B为外周血嵌合抗原受体T细胞，胞体较正常成熟淋巴细胞大，胞体圆形，类圆形；胞浆量丰富，胞浆内易见颗粒，细胞核略不规则，染色质均匀一致，核仁未见）二、流式细胞术分析CAR-T细胞结果通过流式细胞术分析，256例患者外周血或骨髓CAR-T细胞检出可达203例，检出率达79.29%。检测结果同相应形

9、态学检测结果接近。通过CD3Percp.CD4FITC.CD8PE、CD45V500等抗体设门，可以发现CAR-T细胞主要以CD8T淋巴细胞为主。三、形态学与流式细胞术联合分析CAR-T细胞结果2种方法联合分析，256例患者外周血或骨髓CAR-T细胞检出可达254例，CAR-T细胞检出率达99.22%。2种方法CAR-T细胞检出率比率正相关性分析显示，R2=0.9345（图2）o2种方法互相补充，几乎可以检出所有标本中CAR-T细胞，与单一分析方法相比，2种方法联合分析CAR-T细胞检出率（99.22%）高于单纯一种方法检出率（形态学检出率88.28%,流式细胞术检出率79.29%）o60rY

10、=O.9332X+O.0224R2=O.9345O102030405060流式细胞术检出比例(%)图2形态学与流式细胞术检测256例患者外周血嵌合抗原受体-T细胞相关性分析四、形态学与流式细胞术对不同类型标本CAR-T细胞检测结果对外周血不同时间点检测CAR-T细胞比例进行分析，118例多发性骨髓瘤患者标本第7天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为9.50%与10.23%,第15天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为13.50%与15.19%,第21天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为8.00%与10.07%o68例急性淋巴细胞白血病患者标本第7天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为12.0

11、0%与11.22%,第15天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为21.00%与23.10%,第21天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为13.50%与10.91%。70例淋巴瘤患者标本第7天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为7.50%与10.35%,第15天形态学与流式细胞术平均检出率分别为9.00%与10.35%,第21天形态学与流式细胞术平均检出率分别为6.50%与5.69%o讨论目前，对CAR-T细胞检测方法的报道主要以免疫学方法与分子生物学方法9,10,11,12,13o其中免疫学方法，又以流式细胞术为主；分子生物学方法以PCR为主，而且是灵敏度与特异性最佳的方法，可视为CAR-T细

12、胞检测的金标准。每种方法都有一定的优势，同时也存在欠缺与不足之处。流式细胞术可以通过获取大量细胞标本检测CAR-T细胞免疫治疗患者外周血或骨髓中CAR-T细胞的数量及变化,实验方法及流程简单、快速，能够较好满足临床对患者CAR-T细胞免疫治疗疗效的追踪与评估。但是随着CAR-T细胞更新换代的加快及靶标设计多样化，导致很难找到一种可以通用而特异性的检测分子用于流式细胞术检测CAR-T细胞。蛋白1.是一种从消化链球菌中分离出来的细菌表面蛋白,可选择性地与免疫球蛋白的可变轻链结合，而不干扰抗体的抗原结合特性12,13o流式细胞术检测蛋白1.可以检出大部分标本，但因CAR-T细胞设计及来源不同等原因，

13、会有接近20%的CAR-T细胞检测效果不佳，甚至呈阴性。我们进一步分析检出效果不佳的标本类型及特征，发现除却标本送检不及时及特殊用药导致的干扰之外，鼠源化CAR-T细胞比人源化CAR-T细胞检测灵敏度更高。这可能是因为不同种类免疫球蛋白对蛋白1.的特异性结合能力有关。具体的分子机制需要进一步探究及大量数据的验证。通过形态学观察与检测CAR-T细胞，目前尚未见相关报道。我们通过比较CAR-T细胞与其他细胞形态学特点，发现CAR-T细胞较正常淋巴细胞具有非常明显的形态学差异，而且在血液标本和骨髓标本中CAR-T细胞的形态学特征差异明显。总体上，CAR-T细胞体积较正常淋巴细胞大，胞浆丰富且易见颗粒

14、，胞膜边缘较正常淋巴细胞多有数量不等伪足凸起。依据CART细胞形态学特征对相关标本进行检测，检出率较高。对未检出及检测效果不佳的标本，我们进一步分析总结，发现除去样本数量极少不易检出之外，最主要的原因是不同环境中形态学特征变异性较大，个别标本不易区分淋巴瘤细胞、正常T/NK淋巴细胞与CAR-T细胞。甚至出现正常T/NK细胞与具备CAR-T特征的细胞极为相似的情况，但是通过流式分析发现为正常的T/NK细胞。此类标本较少，具体原因及机制需要进一步探究及大量数据的分析。形态学作为一种从未有人尝试过的CAR-T细胞检测方法能够为快速,准确检测CAR-T细胞提供一种有效的途径，但是受检测人员经验水平的影

15、响较大，同时对CAR-T细胞形态学特征的分析缺少一定标准。这些都需要在后期实验与工作中进一步总结归纳，以期制定一套CAR-T细胞形态学特征标准。通过比较目前存在的CAR-T细胞检测方法，我们发现联合形态学与流式细胞术检测CAR-T细胞具备快速，准确，敏感，易于操作等优点。可以很好弥补单一方法检测CAR-T细胞的缺陷与不足。检出率及准确性比单一方法检测显著提高。随着越来越多靶向CAR-T细胞产品应用于临床试验，势必带来CAR-T细胞检测难度的增加，单一方法很难满足高敏感度、特异性和易于复制的方法学要求。联合流式细胞术与形态学方法为快速，准确定量检测患者体内CAR-T细胞提供一种新的思路与方法，可作为CAR-T细胞检测重要的附加评价指标。为准确监测患者体内的CAR-T细胞动态变化对治疗效果评估及辅助治疗都有重要指导意义。