RNAi技术专题讲座PPT.ppt

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1、LOGORNAi技术技术RNA的分类的分类Typesfunctionribosomal RNA(rRNA)messenger RNA(mRNA)transfer RNA(tRNA)heterogeneous nuclear RNA(hnRNA)small nuclear RNA(snRNA)small nucleolar RNA(snoRNA)small cytoplasmic RNAribozymemicroRNA(miRNA)small interfering RNA(siRNA)non-coding RNA(ncRNA)component of ribosometemplate of p

2、rotein synthesistransfer amino acidpremature mRNAparticipate the splicing and transfer of hnRNA,includes spliceosomal RNAprocess and modify rRNArecognize the protein sorting signalcatalytic RNAusually endogenous,induce degradation of targeted mRNA usually exogenous,induce degradation of targeted mRN

3、Aall RNA other than mRNA,priorly functional RNA longer than 200ntRNAi技术技术一、一、RNAi的发现的发现三、三、RNAi的作用机制的作用机制二、二、RNAi的的概念概念四、四、RNAi的特点的特点五、五、RNAi的技术应用的技术应用六、六、RNAi的发展前景的发展前景RNAi技术技术AndrewFireCraigMello2006年诺贝尔生理学奖年诺贝尔生理学奖一、一、RNAi的发现的发现1998年年Andrew Fire和和Craig Mello等人首次证实双链等人首次证实双链RNA分子可诱导同源目标分子可诱导同源目标mR

4、NA降解，导致特定基降解，导致特定基因表达沉默，并将其命名为因表达沉默，并将其命名为RNA干扰干扰2001年年Tuschl，Phil Sharp等人在等人在Nature上首次证实上首次证实哺乳动物细胞中存在哺乳动物细胞中存在RNAi机制机制2002年年Science加州大学里弗塞德分校的加州大学里弗塞德分校的Shou-Wei Ding等人首次证明动物细胞利用等人首次证明动物细胞利用RNA沉默来抵沉默来抵御病毒侵染御病毒侵染2006年年Eugene Koonin等人又证明原核生物里存在类等人又证明原核生物里存在类似于真核生物似于真核生物RNA干扰系统的干扰系统的RNA沉默机制沉默机制v被Scie

5、nce杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。RNAi（RNA interference）RNAi（RNAi interference,RNA干扰干扰)是指在进是指在进化过程中高度保守的、由双链化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源诱发的、同源mRNA高高效特异性降解的现象。是一种转录后水平的基效特异性降解的现象。是一种转录后水平的基因沉默因沉默。二二、RNAi的概念的概念RNAi现象的普遍性现象的普遍性 RNAi普遍存在于水稻、烟草、果蝇及人等几乎所普遍存在于水稻、烟草、果蝇及人等几乎所有真核生物中；

6、有真核生物中；RNAi能高效的特异阻断基因的表能高效的特异阻断基因的表达，在线虫和果蝇体内，达，在线虫和果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的能达到基因敲除的效果效果直接向细胞导入长双链直接向细胞导入长双链RNA(dsRNA)RNA(dsRNA)，在细胞质核酸酶在细胞质核酸酶DicerDicer的作用下可将长的作用下可将长双链双链RNARNA降解为降解为21-23bp21-23bp的小分子干扰的小分子干扰RNARNA（siRNAssiRNAs）这些这些siRNAssiRNAs结合其他元件形成结合其他元件形成“RNARNA诱诱导沉默复合物导沉默复合物”(RISCs)(RISCs)，并引导，并引导RI

7、SCsRISCs结合到与之互补的结合到与之互补的mRNAmRNA序列上，序列上，降解对应的降解对应的mRNA mRNA 导致对应蛋白质水平下降，最终导致目标基因表达沉默(见图，线路1，蓝色)非哺乳动物细胞非哺乳动物细胞RNAi技术路线技术路线转录水平转录水平 转录后水平转录后水平 RNAi作用机制的两种水平三、三、RNAi作用机制作用机制哺乳动物细胞哺乳动物细胞RNAiRNAi技术路线技术路线 直接制备19-23bp左右的siRNAs，将siRNAs转入哺乳动物细胞(线路2，红色)或是将短发夹结构RNA(shRNAs)的DNA表达载体转入细胞，表达产生shRNA，经过Dicer切割后得到siR

8、NA(线路3，黄色)最后siRNAs和其他元件组合成为RNA诱导的沉默复合物RISCs，在siRNA指引下识别对应的mRNA序列并降解mRNA，从而使特定基因表达沉默RNAi技术机制路线图siRNA诱导的基因沉默 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，迅即产生反应，作用机制作用机制其胞质中的核酸内切酶其胞质中的核酸内切酶Dicer将将dsRNA切割成多个具切割

9、成多个具有特定长度和结构的小片段有特定长度和结构的小片段RNA（大约（大约2123 bp），），即即siRNA。siRNA在细胞内在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导诱导的沉默复合物的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。vRISC与外源性基因表达的与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特的同源区进行特异性结合，异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合

10、部位具有核酸酶的功能，在结合部位切割切割mRNA，切割位点即是与，切割位点即是与siRNA中反义链互中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应的降解反应。vsiRNA不仅能引导不仅能引导RISC切割同源单链切割同源单链mRNA，而，而且可作为引物与靶且可作为引物与靶RNA结合并在结合并在RNA聚合酶聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用）作用下下合成更多新的合成更多新的dsRNA，新合成的，新合成的dsRNA再由再由Dicer切割产生大

11、量的次级切割产生大量的次级siRNA，从而使，从而使RNAi的的作用进一步放大，最终将靶作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。完全降解。vDicer(DCR）：是RNAase 家族中的一员，主要切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为小RNAs分子。对应地，我们将这种小RNAs分子命名为siRNAs和miRNA。Dicer有着较多的结构域，最先在果蝇中发现，并且在不同的生物体上表现出很高的保守性。vMicroRNA(miRNA）：是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（21-23个核苷酸）。MiRNA，以及miRISCs（RNA-蛋白质复合物）在

12、动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能，miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。RNAi具有的特征具有的特征 vRNAi是转录后水平的基因沉默机制；是转录后水平的基因沉默机制；vRNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的的单个内源基因的mRNA；vRNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源分子（数量远远少于内源mRNA的数量）的数量）就能完全抑

13、制相应基因的表达，是以催化放大的就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；方式进行的；vRNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；整个有机体以及可遗传等特点；vdsRNA不得短于不得短于21个碱基，并且长链个碱基，并且长链dsRNA也也在细胞内被在细胞内被Dicer酶切割为酶切割为21 bp左右的左右的siRNA，并，并由由siRNA来介导来介导mRNA切割。而且大于切割。而且大于30 bp的的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的不能

14、在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；vATP依赖性：在去除依赖性：在去除ATP的样品中的样品中RNA干扰现干扰现象降低或消失显示象降低或消失显示RNA干扰是一个干扰是一个ATP依赖的过依赖的过程。可能是程。可能是Dicer和和RISC的酶切反应必须由的酶切反应必须由ATP提提供能量。供能量。四、四、RNAi的特点的特点生物体内广泛存在的生物体内广泛存在的RNAiRNAi作用是什么？作用是什么？在小分子RNA中发现了一类与调节基因表达密切相关的分子micro RNA(miRNA)。这种内源性的小分子RNA针

15、对3端非编码区，有着极高的保守性，并在组织中广泛表达，可在转录后以及翻译水平上调控基因表达。病毒防御RNA沉默被认为是低等生物和植物抗病毒防御系统的一道防线基因调控五、五、RNAi技术应用技术应用基因沉默工具RNAi主要通过转录后水平阻断基因的表达，导主要通过转录后水平阻断基因的表达，导致蛋白无法合成，出现致蛋白无法合成，出现“基因沉默基因沉默”。比如，当。比如，当关闭关闭非必须非必须或或致病致病基因的功能。从理论上说，若基因的功能。从理论上说，若能抑制致病基因的表达则很多疾病将被治愈能抑制致病基因的表达则很多疾病将被治愈。动动物实验证明，可以通过物实验证明，可以通过RNAi的方法是胆固醇升的

16、方法是胆固醇升高的基因高的基因“沉默沉默”：病毒性疾病、眼疾、心血管：病毒性疾病、眼疾、心血管代谢性疾病等方面的临床实验也正在进行；这一代谢性疾病等方面的临床实验也正在进行；这一方法为病毒性肝炎，艾滋病，肿瘤等等人类顽疾方法为病毒性肝炎，艾滋病，肿瘤等等人类顽疾的治疗指明道路的治疗指明道路。RNAi文库随着人类基因组计划的完成和蛋白质组随着人类基因组计划的完成和蛋白质组研究的开展，我们的视野不再局限于单研究的开展，我们的视野不再局限于单个的基因，整个研究领域都在期待呼唤个的基因，整个研究领域都在期待呼唤更为强大的、全基因组高度的基因功能更为强大的、全基因组高度的基因功能研究工具。研究工具。RNAi文库文库(RNAi library)是人工构建的是人工构建的能通过诱导沉能通过诱导沉 默众多不同基因表达的默众多不同基因表达的组合文库，可以用于建立功能缺陷组合文库，可以用于建立功能缺陷(loss of function)的生物或细胞库，进行表的生物或细胞库，进行表型的筛选。型的筛选。临床疾病治疗病毒性疾病的治疗病毒性疾病的治疗设计合成的设计合成的lenti病毒载体引入病毒载体引入siRNA，