FISH技术及应用.ppt

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1、荧光原位杂交荧光原位杂交 Fluorescence in situ Hybridization(FISH)nFISH-a process which vividly paints chromosomes or portions of chromosomes with fluorescent molecules荧光原位杂交是一个可以用荧光分子将染色体或部分染色体涂染的 过程nidentify the presence and location of a region of DNA within morphologically preserved chromosome preparations,t

2、hen can identifies chromosomal abnormalities 在保持染色体形态的基础上识别某一段DNA存在与否、位置是否改变，因此可识别染色体异常noften used during M phase but is now used on interphase as well常用于中期分裂相的分析，现在也用于间期细胞的分析荧光原位杂交荧光原位杂交 优势:less labor-intensive method省时省力 for confirming the presence of a DNA segment within an entire genome than oth

3、er conventional methods相比于在基因组中证实DNA片段存在的其他常规方法FISH 操作步骤操作步骤nDenature the chromosomes染色体变性nDenature the probe 探针变性nHybridization杂交nFluorescence staining荧光染色nExamine slides or store in the dark显微分析探针类型Yq12 重复序列探针重复序列探针-14、22着丝粒单色FISH-1号着丝粒探针单色FISH(端粒探针)位点特异性探针全染色体探针双色 FISH多色荧光原位杂交Spectral Karyotyping

4、(SKY)光谱核型分析24 色 FISH多色FISH（着丝粒和端粒特异性探针）M-FISH（染色体条带特异性探针）IB665B376B12IB568D11S4170D11S1348D11S921D11S1322D11S935D11S4045D11S3969D11S1779D11S1330B344A5D11S4205IB3011D11S4172D11S1362AFM337TC5D11S4143D11S1886D11S1343D11S4078D11S1793D11S4129D11S4107D11S4089D11S4402D11S4094D11S4399B1005B31111.111.2111.22

5、13.213.313.1242514.214.314.113.413.52112131415.115.215.315.415.5111222.322.222.123.223.123.3间期FISH Composite Mouse Karyotype with Centromeric&Telomeric Ends of the Genetic Maps Mouse Chromosome 16 tel BAC Detecting Mouse Trisomy 16小鼠三色小鼠三色FISHFISH在辐射生物损伤检测中的应用背景背景 n放射医学领域对急性照射事故后短期内用非稳定性染色体畸变（dic+r）

6、进行剂量估算是目前的“金标准”；对于早先受照和慢性受照，由于dic+r影响细胞分裂而丢失，用于易位分析有较大的限制；n染色体易位不影响细胞分裂，不会随细胞分裂而丢失，理论上电离辐射诱导的dic和易位是相同的，因此染色体易位畸变分析可能用于回顾性剂量估算；染色体易位畸变的分析染色体易位畸变的分析nG显带：步骤繁琐、带型不易控制、分析比较难n荧光原位杂交（FISH）FISH在放射医学中的应用在放射医学中的应用n形式：染色体彩涂(Chromosome Painting)，或者加泛着丝粒探针n应用：原爆幸存者、切尔诺贝利核电站受照人员、清扫工人、前苏联Techa河周围居民(Mayak核设施倾倒核废料)

7、、英国Sellafield核设施工作人员、巴西Goiana事故受照人员FISH估算剂量的方法估算剂量的方法n建立吸收剂量与基因组易位率的剂量效应曲线(标准曲线);n分析和计算要估算剂量人员的外周血淋巴细胞的基因组易位率；n参照标准曲线估算全身吸收剂量Lucas公式公式 PAINT方法仅分析少数几条染色体，观察到的易位率转化成全基因组易位率，参照公式：Fp=2.05fp(1-fp)FG Fp:FISH分析观察到的染色体易位率 FG:全基因组染色体易位率 fp:探针涉及的染色体占整个基因组的份额双色：Fp=2.05 fg(1-fg)+fr(1-fr)-fg fr FG三色：Fp=2.05fg(1-

8、fg)+fr(1-fr)+fy(1-fy)-(fgfr+fgfy+frfy FG应用的假设应用的假设n辐射所诱导的染色体易位率是保持不变的，至少变化很小；n双着丝粒和易位均发生在两条不同染色体的两个断裂上，辐射造成的断裂点在染色体上分布是随机的，断裂点的重接也是随机的，双着丝粒和易位的发生率应相当。n染色体畸变在染色体上和染色体间的分布是随机的，每条染色体发生畸变的概率应与染色体长度成正比影响因素影响因素n年龄、吸烟与否：自发易位频率 1949岁为新生儿的3倍，5079岁老年人是新生儿的10倍，作者认为在低于50岁时，染色体自发易位频率与年龄成直线关系，但从5060岁开始，自发易位频率显著增高

9、，偏离直线，吸烟者偏离更大。Lucas对35名健康对照(098岁)的自发染色体易位频率进行分析，认为自发易位频率与年龄不是直线关系，而为二次方程模式。不能定论不能定论用用PAINT估算剂量的限制性估算剂量的限制性n标准曲线大多为急性照射的；n易位是否稳定存在？细胞寿命(长寿命6年)、复杂易位 10年左右基本稳定n染色体发生畸变的概率是否与染色体长度成正比n有些小片段的易位会错误地计为正常：分辨率最小彩染片段为11.1 0.08Mb，未彩染片段为14.60.6Mb染色体涂染（Chromosome PAINTING）RERF多色FISH方法Biotin标记-绿色荧光Dig-标记-红色荧光Bioti

10、n+Dig-标记-黄色荧光双着丝粒和易位FDicNormal 8TrTrDic+F(7:9)Translocation(8:other)问题问题应用方面的工作n 方法的实施：21 个BAC探针的平衡问题 推广的难度n 与PAINT方法的比较？研究内容研究内容n比较本实验室建立的FISH方法和PAINT方法建立的剂量效应曲线：给予正常外周血样品离体照射一系列的剂量（05 Gy），制备染色体标本，用本室建立的端粒和着丝粒组合的方法（用1、2或4号染色体）进行分析，建立剂量-效应曲线，与已经建立的PAINT剂量-效应曲线进行比较；n在实际剂量估算应用中比较：收集早先事故病人（受照后短期内有生物剂量）

11、的外周血，制备染色体标本，用两种方法进行分析，进行剂量估算。BAC FISH方法观察到的染色体易位正常中期分裂相4号染色体易位用BAC FISH分析05.00Gy 60Co 射线诱导的染色体易位 剂量剂量(Gy)分析细胞数分析细胞数观察到的易位观察到的易位检测易位率检测易位率全基因组易位率全基因组易位率0200010.00050.00050.0010.501500120.008 0.0020.0201.001000230.023 0.0050.0581.50600220.036 0.0080.0913.00400630.158 0.0200.3955.004001710.427 0.0331.

12、080用BAC FISH分析05.00Gy 60Co 射线诱导的染色体易位剂量效应曲线Y=0.043D2+0.0008D+0.0048 R20.9997 用染色体涂染方法观察到的染色体易位正常中期分裂相发生染色体易位用染色体涂染方法分析05.00Gy 60Co 射线离体照射诱发的淋巴细胞染色体易位 剂量剂量(Gy)分析细胞数分析细胞数观察到的易位观察到的易位检测易位率检测易位率全基因组易位率全基因组易位率0100020.001 0.0010.00271.001000200.020 0.0040.0562.00800530.066 0.0090.1843.008001190.149 0.0140

13、.4134.006001540.257 0.0210.7155.005202080.400 0.0281.111用染色体涂染方法建立的05.00Gy 60Co 射线离体照射诱发淋巴细胞染色体易位剂量效应曲线Y=0.043D2+0.006D+0.0036 R20.9998 两个曲线方程的比较BAC FISH：Y=0.043D2+0.0008D+0.0048 R20.9997 PAINT：Y=0.043D2+0.006D+0.0036 R20.9998 早先事故病人的剂量估算方法分析细胞数观察到易位数检测到的易位率全基因组易位率估算的剂量（Gy）BAC FISH1235140.01130.0290

14、.724PAINT1000110.01100.0320.756Dic+R0.6541.005结论结论n用1、2和4号染色体端粒和着丝粒的BAC FISH和PAINT方法建立的辐射诱发染色体易位的剂量-效应曲线方程系数相同；n初步研究两种方法进行回顾性剂量重建相差不大，但需要进一步研究的验证病例分析细胞观察到易位基因组易位率估算剂量（Gy）先前估算剂量(Gy)11000120.033 0.0190.76(0.43-0.99)0.65-1.012500540.298 0.0822.55(2.15-2.89)2.61(2.40-2.80)3500170.094 0.0231.38(1.18-1.56)1.44(1.21-1.61)4500410.228 0.0702.22(1.41-2.54)2.0*小结小结n事故受照人员在照后十年内用FISH方法来进行回顾性剂量重建，所得到的生物剂量是可靠的；nFISH用于事故剂量分析仍需大量的工作。