第四章：抗生素效价 的微生物检定法.ppt

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1、第四章：抗生素效价的微生物检定法教学目标：第四章：抗生素效价的微生物检定法教学目标：.解释抗生素概念、叙述医疗用抗生素特点、了解释抗生素概念、叙述医疗用抗生素特点、了解抗生素的主要作用机制解抗生素的主要作用机制.叙述抗生素的效价和单位及其表示方法叙述抗生素的效价和单位及其表示方法.熟知抗生素效价检定操作与基本要求熟知抗生素效价检定操作与基本要求.述说测定原理述说测定原理教学重点：教学重点：抗生素概念、医疗用抗生素特点、抗生素的效价抗生素概念、医疗用抗生素特点、抗生素的效价和单位及其表示方法和单位及其表示方法 抗生素效价检定操作方法与基本要求抗生素效价检定操作方法与基本要求教学难点：教学难点：抗

2、生素效价检定操作方法抗生素效价检定操作方法二剂量法效价计算公式二剂量法效价计算公式抗生素的主要作用机制抗生素的主要作用机制讲授新课：第一节讲授新课：第一节 概述概述一、抗生素的概念一、抗生素的概念:抗生素主要是由微生物所产生的极微量便具抗生素主要是由微生物所产生的极微量便具有选择性地杀死或抑制它种生物或肿瘤、细胞生长的一类天有选择性地杀死或抑制它种生物或肿瘤、细胞生长的一类天然有机化合物。然有机化合物。二、医药用抗生素的特点具备以下二、医药用抗生素的特点具备以下4 4个特点才能应用到临床。个特点才能应用到临床。(1)(1)有较大的差异毒力有较大的差异毒力 是由抗生素的作用机制决定的是由抗生素的

3、作用机制决定的,如青如青霉素类抗生素能抑制细菌细胞壁的合成，而对人与哺乳动物霉素类抗生素能抑制细菌细胞壁的合成，而对人与哺乳动物没有影响没有影响,因而该类抗生素具有明显的差异毒力。因而该类抗生素具有明显的差异毒力。(2)(2)抗菌活性强抗菌活性强 抗菌活性的强弱常用最低抑菌浓度抗菌活性的强弱常用最低抑菌浓度(MIC)(MIC)来来衡量，衡量，MICMIC值越小，表示活性越强。值越小，表示活性越强。(3)(3)抗菌谱广抗菌谱广 即指各种抗生素所能抑制或杀灭微生物的范围，即指各种抗生素所能抑制或杀灭微生物的范围，范围广谱者称为广谱抗生素，即对多种病原菌都有抑制和杀范围广谱者称为广谱抗生素，即对多种

4、病原菌都有抑制和杀灭作用；范围窄的为窄谱抗生素，如青霉素主要抑制革兰阳灭作用；范围窄的为窄谱抗生素，如青霉素主要抑制革兰阳性菌，多粘菌素只能抑制革兰阴性菌，而具有抗肿癌作用的性菌，多粘菌素只能抑制革兰阴性菌，而具有抗肿癌作用的抗生素则称为抗肿瘤抗生素。抗生素则称为抗肿瘤抗生素。(4)(4)不产生副作用和不良反应不产生副作用和不良反应 良好的抗生素应对机体无毒良好的抗生素应对机体无毒性，不引起变态反应，不易使病原菌产生耐药性。性，不引起变态反应，不易使病原菌产生耐药性。三、抗生素效价微生物测定技术三、抗生素效价微生物测定技术（一）概述（一）概述效价测效价测定技术定技术方法方法物理、化学法物理、化

5、学法微生物法微生物法简便、快速，本身纯度不高，简便、快速，本身纯度不高，采用该法会引起偏差，因此只采用该法会引起偏差，因此只有在纯度较高情况下可采用有在纯度较高情况下可采用原理和临床应用的要求相一原理和临床应用的要求相一致，直接反映出抗生素的疗致，直接反映出抗生素的疗效，且灵敏度较高，需用量效，且灵敏度较高，需用量较小，因此被广泛使用。较小，因此被广泛使用。微生微生物法物法依据抗生素最小抑菌浓度而设计的稀释法；根据不同浓依据抗生素最小抑菌浓度而设计的稀释法；根据不同浓度的抗生素对微生物生长速度的不同影响程度而设计的度的抗生素对微生物生长速度的不同影响程度而设计的比浊法比浊法中国药典中国药典称之

6、为浊度法并收载称之为浊度法并收载；有依据抗；有依据抗生素渗透到含敏感菌的琼脂培养基中产生抑菌圈而设计生素渗透到含敏感菌的琼脂培养基中产生抑菌圈而设计的管碟法的管碟法(又称扩散法，杯碟法或垂直扩散法又称扩散法，杯碟法或垂直扩散法)；根据对微生物呼吸抑制程度而设计的呼吸度量法；根根据对微生物呼吸抑制程度而设计的呼吸度量法；根据对微生物代谢产物的影响而设计的快速法，对微生据对微生物代谢产物的影响而设计的快速法，对微生物体内酶系统产生影响的脱氢法。物体内酶系统产生影响的脱氢法。浊度法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作浊度法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌

7、浊度值的大小，比较标准品与供用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的种方试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的种方法。法。管碟法：是利用抗生素在含敏感试验菌的琼脂培养基中的球管碟法：是利用抗生素在含敏感试验菌的琼脂培养基中的球面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。通过琼脂培养面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。通过琼脂培养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素浓度基，可观察并测量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量范围内，对数剂量(浓度浓度)与抑菌圈的表面积或直径成正比与抑菌圈的表面积或直径成正比（二）抑菌

8、圈的形成（二）抑菌圈的形成将不锈钢小管将不锈钢小管(俗称为牛津杯俗称为牛津杯)放置在含敏感试验菌的琼脂培养基上，将抗放置在含敏感试验菌的琼脂培养基上，将抗生素溶液注入小钢管中，抗生素分子随溶剂向培养基内呈球面状放射状扩生素溶液注入小钢管中，抗生素分子随溶剂向培养基内呈球面状放射状扩散。同时将培养基置入适宜试验菌生长的培养箱中，琼脂培养基中的试验散。同时将培养基置入适宜试验菌生长的培养箱中，琼脂培养基中的试验菌开始生长。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度，随离开小钢管的距离增菌开始生长。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度，随离开小钢管的距离增大而降低，离小钢管愈远，琼脂培养基中抗生素分子愈少，相应的抗生

9、素大而降低，离小钢管愈远，琼脂培养基中抗生素分子愈少，相应的抗生素浓度愈低。当抗生浓度愈低。当抗生 素分子扩散到一定时间，在素分子扩散到一定时间，在 小钢管周围形成一个能有效小钢管周围形成一个能有效 的抑制试验菌生长的范围，的抑制试验菌生长的范围，也就是通常所说的抑菌圈。也就是通常所说的抑菌圈。抗生素溶液的浓度不同，抑抗生素溶液的浓度不同，抑 菌圈的大小亦不同菌圈的大小亦不同(图图41)。按设计原理不同分按设计原理不同分管管碟碟法法一剂量法（标准曲线法）一剂量法（标准曲线法）二剂量法（二剂量法（22法）法）三剂量法（33法）日常使用多采用二剂量法，对于有争议结果，必日常使用多采用二剂量法，对于

10、有争议结果，必须使用三剂量法测定的结果仲裁。另外再介绍浊须使用三剂量法测定的结果仲裁。另外再介绍浊度法；考虑到一剂量法（标准曲线法）在研制新度法；考虑到一剂量法（标准曲线法）在研制新药的使用和美国药典、日抗基均有收载，本教材药的使用和美国药典、日抗基均有收载，本教材以选讲形式进行介绍。以选讲形式进行介绍。第二节第二节 抗生素的效价和单位抗生素的效价和单位 一、抗生素的效价和单位一、抗生素的效价和单位 抗生素的含量用效价和单位表示。该词有时不加区别抗生素的含量用效价和单位表示。该词有时不加区别统称为效价单位。统称为效价单位。效价（效价（otency）指检品的实际单位数与其标示量的）指检品的实际单

11、位数与其标示量的比值。常表示为效价的百分数。效价是从比较检品与标准品比值。常表示为效价的百分数。效价是从比较检品与标准品的生物活性而得。在不同的微生物效价测定中，效价计算的的生物活性而得。在不同的微生物效价测定中，效价计算的公式见后述。公式见后述。单位（单位（unit,u）单位是衡量抗生素有效成分的具体尺度。）单位是衡量抗生素有效成分的具体尺度。各种抗生素的单位含义不同，在习惯上根据它们的实际发展各种抗生素的单位含义不同，在习惯上根据它们的实际发展情况而定，抗生素效价单位的具体表示方法见后述。情况而定，抗生素效价单位的具体表示方法见后述。标准品与国际单位标准品与国际单位(internation

12、al unit,iu)抗生素微生物测定用的标准品，除国内的新品种外，抗生素微生物测定用的标准品，除国内的新品种外，凡已制备国际标准品的品种，在制备国家标准品时，均与国凡已制备国际标准品的品种，在制备国家标准品时，均与国际标准品比较而定出效价。际标准品比较而定出效价。二、抗生素的效价单位的表示方法二、抗生素的效价单位的表示方法、质量单位、质量单位 以抗生素的生物活性部分质量作以抗生素的生物活性部分质量作单位，微克（）单位，毫克单位，微克（）单位，毫克单位。单位。、类似质量单位、类似质量单位 以特定的纯粹抗生素盐类以特定的纯粹抗生素盐类的质量作为单位。如纯粹金霉素盐酸盐及四的质量作为单位。如纯粹金

13、霉素盐酸盐及四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）微克（）单位，毫克微克（）单位，毫克个单位。这是根据国际使用习惯而来的。个单位。这是根据国际使用习惯而来的。、质量折算单位、质量折算单位 以特定的纯抗生素盐的以特定的纯抗生素盐的质量为单位而加以折算。质量为单位而加以折算。、特定单位、特定单位 以特定的抗生素样品的某一质以特定的抗生素样品的某一质量定为一单位。量定为一单位。第三节第三节 管碟法测定操作管碟法测定操作 1.1.试验用菌液试验用菌液(见表见表4-4)4-4)、缓冲液缓冲液、培养基的制备培养基的制备 按药典规定进行制备。按药典规定进行制备。2

14、.标准品与供试品溶液的制备标准品与供试品溶液的制备 按药典规定制备标准品按药典规定制备标准品与供试品高低不同浓度溶液。与供试品高低不同浓度溶液。(见表见表4-3和和4-11)。3.双碟的制备双碟的制备 制备底层及含一定量试验菌的菌层，并安制备底层及含一定量试验菌的菌层，并安置小钢管。置小钢管。4.滴加药液到小钢管内滴加药液到小钢管内 将标准品、供试品溶液滴入相应将标准品、供试品溶液滴入相应的小钢管中。的小钢管中。5.培养培养 在恒温培养箱中培养至规定时间。在恒温培养箱中培养至规定时间。6.测量抑菌圈测量抑菌圈 可用手工测量或仪器测量。可用手工测量或仪器测量。7.计算结果计算结果 先进行可靠性测

15、验先进行可靠性测验,符合规定符合规定,再进行效价计算再进行效价计算标准品的称量标准品的称量 标准品的稀释标准品的稀释标准品溶标准品溶液液 供试品的称量供试品的称量 供试品的稀释供试品的稀释供试品溶液供试品溶液 缓冲液的制备缓冲液的制备 培养基的制备培养基的制备 底层底层20 ml20 ml菌层菌层5ml 5ml 平板的制备平板的制备 凝固后 凝固后 菌液的制备菌液的制备 加菌液加菌液 加小钢管-可靠性测验，计算结果可靠性测验，计算结果 测量抑菌圈测量抑菌圈培培 养养 抗生素效价检定管抗生素效价检定管碟法碟法操作流程操作流程第三节第三节 管碟法测定操作管碟法测定操作加陶瓦园盖加陶瓦园盖二、影响因

16、素的控制二、影响因素的控制1直线斜率的控制斜率小，即抗生素浓度差异小，直线斜率的控制斜率小，即抗生素浓度差异小，而抑菌圈的直径差异大，灵敏度的准确性高。而抑菌圈的直径差异大，灵敏度的准确性高。2直线截距的控制直线截距决定于直线截距的控制直线截距决定于C、D、T、H诸诸因素，其中因素，其中D、T值一般相当稳定，所以值一般相当稳定，所以C、H是决定截距是决定截距的主要因素。如将培养基厚度的主要因素。如将培养基厚度H减小，截距也随之减小，抑减小，截距也随之减小，抑菌圈增大。据此可设计薄层培养基，可大大提高检验的灵菌圈增大。据此可设计薄层培养基，可大大提高检验的灵敏度敏度 3抑菌圈大小的控制抑菌圈的大小受抑菌圈大小的控制抑菌圈的大小受L、H、C、D、T及及A等诸因素的影响。抗生素总量等诸因素的影响。抗生素总量MCVCAL，（，（A为为管底面积、管底面积、L为高度、为高度、V为管内体积、为管内体积、C为抗生素浓度）为抗生素浓度）,可可见抗生素浓度是影响抑菌圈大小的，若见抗生素浓度是影响抑菌圈大小的，若C C不变，则不变，则r r随随V V而而变化，那么变化，那么L L或或A A均影响抑菌圈大小。