大型底栖无脊椎动物环境DNA 监测技术规范.docx

《大型底栖无脊椎动物环境DNA 监测技术规范.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大型底栖无脊椎动物环境DNA 监测技术规范.docx（18页珍藏版）》请在优知文库上搜索。

1、ICS点击此处添加ICS号CCS点击此处添加CCS号DBll北京市地方标准DB11/TXXXXX-XXXX大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范TechnicalspecificationforenvironmentalDNAmonitoringofbenthicmacroinvertebrates（点击此处添加与国际标准一致性程度的标识）（征求意见稿）XXXX -XX-XX 发布XXXX-XX-XX实施北京市市场监督管理局发布目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14环境DNA监测原则及流程25试剂和材料36仪器和设备57样品58分析步骤79结果分析810质量保证和质量控制91

2、1注意事项1012废物处置10附录A（资料性）大型底栖无脊椎动物常用扩增引物11附录B（资料性）环境DNA采样记录表12附录C（资料性）沉积物样品采集和前处理13附录D（资料性）大型底栖无脊椎动物监测结果记录表14本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由北京市生态环境局提出并归口。本文件由北京市生态环境局组织实施。本文件起草单位：北京市生态环境监测中心、中国科学院生态环境研究中心。本文件主要起草人：常淼、杜泽瑞、沈秀娥、孙成华、陈圆圆、刘康、任帅、晁晶迪、马秋月、贺鑫、战爱斌、熊薇、陈义永。大型底栖无脊椎动物环境DNA监测技术规范

3、1范围本文件规定了大型底栖无脊椎动物环境DNA监测的样品采集、保存、运输、分析、质量保证与质量控制等技术要求。本文件适用于北京市范围内河流、湖泊、水库等淡水水域类型中大型底栖无脊椎动物的监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T30989高通量基因测序技术规程GB/T35537高通量基因测序结果评价要求HJ91.2地表水环境质量监测技术规范HJ494水质采样技术指导HJ1295水生态监测技术指南河流水生生物监测与评价（试行）

4、HJ1296水生态监测技术指南湖泊和水库水生生物监测与评价（试行）DBl1/T1368实验室危险废物污染防治技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。31大型底栖无脊椎动物benthicmacroinvertebrates指生活史的全部或至少一个时期栖息于内陆淡水（包括流水和静水水体）的水底表面或底部基质中的大型无脊椎动物类群。主要由腔肠动物、扁形动物、线形动物、线虫动物、环节动物、软体动物和节肢动物及其幼虫等组成。环境DNAenvironmentaIDNA（eDNA）从生物生活环境中直接提取到的不同物种DNA的总和，包含生物脱落、释放的细胞或游离的DNA。高通量测序high-throu

5、ghputsequencing区别于传统双脱氧链末端终止法（Sanger）测序，能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术。DNA条形码DNAbarcodingDNA条形码是一段标准的、短小的、易于PCR扩增的、物种间有足够变异且物种内相对保守的、能够代表该物种的基因序列。本标准选用大型底栖无脊椎动物常用的后生动物线粒体基因组上的线粒体细胞色素C氧化酶I对应的DNA序列（C（H基因）作为目标序列。asDNA宏条形码技术DNAmetabarcoding利用高通量测序技术获取环境样本（如水、沉积物等）中的COI基因序列，根据物种间特定DNA序列差异识别物种，获取物种组成和群落结构的技术。1

6、A聚合酶链式反应polymerasechainreaction（PCR）-种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，包括变性、退火、延伸等主要步骤。索引IndeX通过PCR或文库准备过程中为每个样品添加一个短核甘酸碱基链，多个样品在一个高通量测序运行中同时检测。每个样本添加了样品特异性的短核甘酸链，在处理测序数据时可以用于区分不同样本，实现大量样本的高通量混合检测。A引物PrimerPCR反应中用于与目的DNA片段5,端结合的寡核甘酸链。由于DNA聚合酶不能直接在模板链上合成DNA链，只能从引物的3端开始延伸DNA链，因此DNA复制需要以引物作为起始。操作分类单元OPeratiOnalta

7、xonomicunit；OTUDNA宏条形码技术中，测序数据按照一定的序列相似性阈值进行聚类，获得的用于表征物种的分子水平的分类单元。相对丰度relativeabundance样品中分配到某一分类单元的序列数占该样品序列总数的比例。2 11阳性对照样品PositivecontrolSamPIe己知物种组成的基因组DNA或人工合成含有目标序列的基因片段的混合物，与待测样本同步实验，用于判断结果是否可靠。4环境DNA监测原则及流程41监测原则4.1.1 科学性原则大型底栖无脊椎动物环境DNA监测应客观、科学地反映监测对象的实际状况，符合生态学和环境科学的基本原理和要求。4.1.2 代表性原则监测结

8、果应能在物种及相对丰度等方面全面客观反映监测水域大型底栖无脊椎动物群落的整体状况。在水生态环境监测业务部门现有技术水平和资源配置的条件下，以支撑环境管理为目标，优先采用效率高、成本低、方法简、操作易的监测方法。4.1.4 可比性原则大型底栖无脊椎动物群落及生境的时空变化具有长期性、复杂性，监测点位、方法、指标、时间和频次等一经确定，应尽量保持延续性，使监测结果可比。4.1.5 保护性原则监测工作以保护和恢复为最终目标，因此在监测过程中应避免伤害野生生物、破坏生态环境和超出客观需要的频繁采样。4.1.6 安全性原则监测工作具有一定的风险，监测人员应接受相关专业培训，并做好安全防护措施。4.1.7

9、 D监测流程大型底栖无脊椎动物环境DNA监测流程见图1。一监测方案制定准备阶段监测安H林口准备样品采集现场采样阶段环境DNA富集I一样品运输和保存一DNA提取样品处理阶段DNA化一DNA质量检测一PCR扩增实验室分析阶段高通量测序数据处理、结果记录图1监测流程图4.1.8 1试剂基本要求除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。实验用水应满足GB/T6682中一级水要求。4.1.9 7采样及前处理试剂和材料5.2.1含氯消毒剂：市售的含氯消毒剂有效氯浓度5g/100mL左右。使用时稀释至使用浓500mg/L左右。5.2.275%乙醉：可由无水乙醇和超纯水3:1配制。5. 2.3采样瓶

10、或采样袋：1L螺口旋盖的高密度聚乙烯塑料瓶或市售的无菌采样袋。6. 2.4无菌微孔滤膜：混合纤维素酯滤膜，直径47nun,孔径0.45u7. 2.5离心管：1.5mL2niL、5mL和50mL,无DNA和生物残留。K1环境DNA提取试剂推荐采用市售商品化的DNA提取纯化试剂盒。如使用CTAB法提取DNA所需试剂如下：a)乙二胺四乙酸二钠(NazEDTA,C10HHN20sNa22H20)。b)氢氧化钠(NaOH)oc)EDTA溶液：P(EDTA)=0.02mol/L：称取5.8448gEDTA溶于适量超纯水中，NaOH固体调节PH至8.0,定容至IooOmL,121灭菌18min,冷却后常温保

11、存。d)三羟甲基氨基甲烷(Tris,C1H11NO3)oe) 浓盐酸：P(HCI)=LI9g/mL。f) Tris-HCl溶液：P(Tris-HCl)=0.1mol/L：称取15.76gTris-HCl溶于适量超纯水中，浓盐酸调PH至8.0,定容至IooOmL,121灭菌18min,冷却后常温保存。g)十六烷基三甲基溟化铁(CTAB)oh) 氯化钠(NaCl)oi) CTAB提取液：称取4gCTAB和16.38gNaCb分别溶于适量超纯水中，加入0.02mol/LEDTA溶液(5.3c)8mL和0.1mol/LTris-HCl溶液(5.3f)20mL,定容至200mL,121灭菌18min,冷

12、却后常温保存。j) TriS饱和酚(pH=8.0)。k)三氯甲烷(CHC13)o1)异戊醇(CsHU)om)酚氯仿：Tris饱和酚、氯仿和异戊醇按25:24:1体积比配制。n)乙酸核(CCOONHl)o)乙酸筱溶液，P(CH3C00NH4)=7.5mol/L：称取5.78g乙酸镂溶于IomL超纯水中。p)乙酸钠(CH3C00Na3压0)。q)乙酸钠溶液，P(CH3COONa)=3mol/L：称取102.06g乙酸钠溶于适量超纯水中，冰醋酸调节PH至5.2,定容至250mL,121灭菌18min；r)无水乙醇(C2H6O)os)冰乙酸(C2O2)ot)蛋白酶K：400WmL0u)超纯水：经121

13、,0.1MPa灭菌30min,无细菌无DNA酶。耳4PCR扩增试剂和材料5.4.1大型底栖无脊椎动物PCR通用引物：大型底栖无脊椎动物环境DNA引物可选择一对或多对，推荐的引物参照表A.U5.4.2PCR扩增试剂：推荐市售商品化的PCR扩增试剂套装，包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg?和PCR缓冲液等。5.4.3PCR管、96孔板等PCR反应容器：无DNA和生物残留。K4DNA凝胶电泳试剂和材料5.5.1电泳级琼脂糖用于配制现琼脂糖：加热至恰好全部熔化，冷却至合适温度倒入制胶槽中，插入制胶梳，冷却凝固拔出制胶梳后检查上样孔是否完整无损。5.5.2电泳缓冲液推荐使用TAE缓冲液（50X）,

14、取乙二胺四乙酸二钠（5.3a）37.2g,三羟甲基氨基甲烷（5.3d）242g,用约800mL超纯水（5.3U）溶解，加入冰乙酸（5.3s）57.1mL,搅拌均匀后，用氢氧化钠（5.3b）调PH至&3,定容至1L,灭菌后常温备用。5.5.3DNA分子量标准（含上样缓冲液）标记范围100bp-2000bp,标记精度通常为50bp、100bp、1kb等。5.5.4DNA染料推荐采用市售的商品SYBR型或SYBRSafe型等无毒性或者低毒性DNA染料，按照说明书操作，在凝胶染色和成像观察时做好防护措施。5.5.5PCR产物纯化试剂推荐使用市售的商品化PCR产物纯化试剂盒。6仪器和设备Al采水器：1L

15、、2L、3L等规格，不锈钢或有机玻璃材质。65过滤装置：配有砂芯滤器和真空泵，抽滤压力不应超过-50kPa。A1恒温烘箱：室温250可调。64水浴锅：室温IO（TC可调。6S高压蒸汽灭菌器：可达到121C,0.1MPa灭菌条件。AA超净工作台：具有初效、高效过滤器和紫外灯。61PCR仪：PCR反应程序可编辑。AA水平电泳仪：工作电压100V120V可调。40离心机：离心力可达12000rmin,温度可控制在4A1CDNA浓度分光光度计：最小测量体积达到1PL,波长范围包括230nm、260nm和280nmo611凝胶成像仪：302nm光源，具备成像拍照功能。615高通量测序仪：测序读长不低于250bp,一次测序反应能产出不低