第14章基因工程.ppt

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1、目目 录录Dolly,the first mammal to be cloned from an adult cell,Is shown here with her naturally conceived first lamb,Bonnie.卵细胞卵细胞（去核）（去核）B乳腺细胞乳腺细胞（6岁羊）岁羊）A细胞融合细胞融合电脉冲电脉冲胚胎细胞转移转移子宫内发育子宫内发育CDollyDolly的一生的一生1996年年7月月5日，生物学界发生了一件轰动世界的大事：克隆羊多莉诞生。日，生物学界发生了一件轰动世界的大事：克隆羊多莉诞生。1997年年2月月27日，英国日，英国自然自然杂志全文刊登罗斯林研究

2、所的实验结果。杂志全文刊登罗斯林研究所的实验结果。1998年年4月月13日凌晨时生下一只雌性的体重日凌晨时生下一只雌性的体重2.7千克的小羊羔，取名千克的小羊羔，取名“邦妮邦妮”。1999年，多莉一家又迎来了年，多莉一家又迎来了3个可爱的羊宝宝。个可爱的羊宝宝。2003年年2月月14日，英国一个名叫多莉的克隆羊，因患严重肺病而接受日，英国一个名叫多莉的克隆羊，因患严重肺病而接受“安乐死安乐死”。目目 录录第第 二二 节节 重组重组DNADNA技术技术DNA Recombination Technique 目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录

3、目目 录录目目 录录目目 录录n相关概念相关概念nDNADNA克隆克隆n工具酶工具酶n目的基因目的基因n基因载体基因载体n基本原理基本原理 n重组重组DNADNA技术与医学的关系技术与医学的关系本节主要内容本节主要内容目目 录录克隆克隆(clone)(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)(cloning)，即，即无性繁殖无性繁殖。（一）（一）DNADNA克隆克隆技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)(molecular clone)即即DNA

4、 DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）目目 录录应用酶学的方法，在体外将各种来源的应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传遗传物质物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNADNA）与载体与载体DNADNA接合接合成一具有自我成一具有自我复制能力的复制能力的DNADNA分子分子复制子复制子(replicon)(replicon)，继而，继而通过通过转化或转染转化或转染宿主细胞，宿主细胞，筛选筛选出含有目的基因出含有目的基因的转化子细胞，再进行的转化子细胞，再进行扩增扩增提取获得大量同一提取获得

5、大量同一D N AD N A 分 子，也 称分 子，也 称 基 因 克 隆 或 重 组基 因 克 隆 或 重 组 D N A D N A(recombinant DNA)(recombinant DNA)。DNADNA克隆克隆 (DNA cloning)(DNA cloning)目目 录录（二）工具酶（二）工具酶n 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n DNADNA聚合酶聚合酶nT4DNAT4DNA连接酶连接酶n逆转录酶逆转录酶n碱性磷酸酶碱性磷酸酶n 末端转移酶末端转移酶n TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶-“缝纫针缝纫针”-“基因剪刀基因剪刀”目目 录录重组重组DNADNA技术中常用

6、的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNADNADNA连接酶连接酶催化催化DNADNA中相邻的中相邻的5 5 磷酸基和磷酸基和3 3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNADNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNADNA分子或片段连接分子或片段连接DNADNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNAcDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNADNA序列分析序列分析填补填补3 3 末端末端KlenowKlenow片段片段又名又名DNADNA

7、聚合酶聚合酶I I大片段，具有完整大片段，具有完整DNADNA聚合酶聚合酶I I的的5 53 3 聚合、聚合、3 35 5 外切活性，而无外切活性，而无5 53 3 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNAcDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNAcDNA替代替代DNADNA聚合酶聚合酶I I进行填补，标记或进行填补，标记或DNADNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 3 羟基末端进行同质多聚物加尾

8、羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目目 录录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶-“基因剪刀基因剪刀”定义定义限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonucleaserestriction endonuclease,RERE)是是识别识别DNADNA的特异序列的特异序列,并在识别位点或其周围并在识别位点或其周围切割切割双链双链DNADNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGG GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G GBam Bam HH目目 录录作用作用与甲基化酶共同构成细菌的与甲基

9、化酶共同构成细菌的限制修饰限制修饰系统系统，限制外源，限制外源DNADNA，保护自身保护自身DNADNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）目目 录录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名H Hinind d 属属 系系 株株 序序H Haemophilus aemophilus ininfluenzae fluenzae d d株株流感嗜血杆

10、菌流感嗜血杆菌d d株的第三种酶株的第三种酶目目 录录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口目目 录录BamHGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口 blunt end粘端切口粘端切口sticky end目目 录录同功异源酶同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGG G

11、CCTAGCCTAGGATCCGATCC G GBamBamHHGGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGG GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G GBstBst目目 录录有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNADNA后，产生后，产生相同的粘性末端相同的粘性末端，称为称为同尾酶同尾酶。这两个相同的粘性末端称为。这两个相同的粘性末端称为配配伍未端伍未端(compatible end)(compatible end)。GGATCC GGATCC CCTAGG CCTAGG AGATCT AGATCT TCTAGA TCTAG

12、AG GCCTAGCCTAG GATCC GATCC G GA ATCTAGTCTAG GATCTGATCT A A同尾酶同尾酶目目 录录目目 录录（三）目的基因（三）目的基因 （target DNAtarget DNA）“乘客乘客”n cDNA(complementary DNA)cDNA(complementary DNA)反转录合成，与反转录合成，与mRNAmRNA互补的单链互补的单链DNADNAn基因组基因组DNA(genomic DNA)DNA(genomic DNA)一个细胞或生物体整套遗传信息一个细胞或生物体整套遗传信息的所有的所有DNADNA序列序列目目 录录（四）基因载体（四

13、）基因载体“交通工具汽车交通工具汽车”定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些达有意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNADNA噬菌体噬菌体DNADNA病毒病毒DNADNA目目 录录克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)(expression vector)为使插入的外源为使插入的外

14、源DNADNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。目目 录录载体的选择标准载体的选择标准n能自主复制；能自主复制；n具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；和鉴定；n有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNADNA插入点），常具有多个单插入点），常具有多个单一酶切位点，称为一酶切位点，称为多克隆位点（多克隆位点（MCSMCS）；n分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNADNA。目目 录录1.1.质粒质粒 (plasmid)(plasmid)质粒：存在于细菌染色体之

15、外的能独立自主复制环状双链质粒：存在于细菌染色体之外的能独立自主复制环状双链DNADNA分子。带有某些遗传信息分子。带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性会赋予宿主细胞一些遗传性状状目目 录录ori目目 录录噬菌体噬菌体DNADNA改造系统改造系统 gtgt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNAcDNA克隆）克隆）EMBLEMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.2.噬菌体噬菌体(phage)(phage)M13M13噬菌体噬菌体DNADNA改造系统（含改造系统（含lacZlacZ基因的基因的NN端）端）M13mpM13mp系列系列pUCpUC系列系列目

16、目 录录3.3.粘性质粒粘性质粒(cosmid)(cosmid)一种人工构建的克隆一种人工构建的克隆载体，包含了载体，包含了噬菌噬菌体的体的coscos基因。能被包基因。能被包装到装到噬菌体粒子中，噬菌体粒子中，感染大肠杆菌；它携感染大肠杆菌；它携带入宿主细菌的带入宿主细菌的DNADNA片段（超过片段（超过45kb45kb）要）要比质粒载体携带的要比质粒载体携带的要大大目目 录录酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome,YAC)(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome,BAC)(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNADNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他目目 录录二、重组二、重组DNADNA技术基本原理技术基本原理基本过程基本过程目的基因的获取目的基因的获取DNADNA导入受体菌导入受体菌外源