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1、过表达ABAD对AB2刺激的293T细胞线粒体功能和自噬水平的影响洪婷婷张宇崔理立()广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524001【摘要】目的探讨Api/刺激下,在293T细胞中过表达ABAD对线粒体功能的影响及自噬相关标记蛋白水平的变化。方法293T细胞分别经APM2(5M10M20M)处理后,ATP试剂盒测定其细胞ATP含量;活性氧试剂盒测定其活性氧生成量。自噬诱导剂处理后,WeSternbIot观察线粒体自噬相关蛋白表达量的改变。通过标准曲线换算ATP细胞含量和活性氧生成量,用ImageJ对WeSternbIOt条带进行量化。结果对照组与293T过表达ABAD组ATP
2、含量和活性氯生成量无明显差异(P均0.05);与不给药组相比,在给予Aj2(IOuM)刺激后,293T细胞过表达ABAD的ATP含量减少,差异具有统计学意义(P0.05);与DMSO处理对照组相比,CCCP自噬诱导剂处理组在Apb42IOuM诱导后线粒体自噬相关蛋白P62降低、LC3B升高,差异均有统计学意义(PvO.O5)o结论过表达ABAD不影响293T细胞的线粒体功能,但在特定浓度A,42刺激下可影响线粒体ATP产生及促进线粒体自噬发生。【关键词】:ABAD,A,线粒体功能:线粒体自噬;【中图分类号】R74【文献标识码】AEffectsofoverexpressionofABADonmi
3、tochondrialfunctionandautophagyof293TcellsstimulatedbyA,42HONGTing-tingZHANGYuCUILI-li*Guangdongprovincialkeylaboratoryofagerelatedheartandbraindiseases,GuangdongMedicalUniversityZhanjiang524001,Guangdong,ChinaAbstractobjectivetoinvestigatetheeffectofoverexpressionofABADonmitochondrialfunctionandthe
4、levelofautophagy-associatedmarkerproteinin293TcellsstimulatedbyA32Methods293TcellsweretreatedwithAp42(5uM,IOuM,20uM)respectively,andtheirATPcontentwasmeasuredbyATPkit,andtheproductionofreactiveoxygenspecies(Ros)wasmeasuredbyRosKit.Aftertreatedwithautophagyinducer,theexpressionofMitochondrialautophag
5、y-relatedproteinswasobservedbyWesternblot.TheamountofATPcellsandreactiveOxygenSpecies(Ros)werecalculatedbystandardcurve,andtheWesternblotwasquantifiedbyImageJ.ResultstherewasnosignificantdifferenceinArPcontentandreactiveoxygenspeciesproductionbetweenthecontrolgroupand293Toverexpressionabacigroup(P0.
6、05);comparedwiththecontrolgroup,theATPcontentof293TcellsoverexpressionABADwasdecreasedafterAm2(IOuM)stimulation,thedifferencewasstatisticallysignificant(P0.05);comparedwiththecontrolgrouptreatedwithDMSO,mitochondrialautophagyrelatedproteinP62decreasedandLC3BincreasedinthegrouptreatedwithCCCPautophag
7、yinducerafterAB.42(IOuM)stimulation(PBCA蛋白检测盒(美国ThermO公司),ABAD过表达质粒、ABAD干扰质粒(上海毅乐生物),增强型ATP检测试剂盒、活性氧检测试剂盒(碧云天生物技术),CCCP(MCE),A1.42(上海强耀生物科技有限公司),DMSO(青岛生物科技),抗体:LC3B(Sigma),P62、ABAD(Abcam),P-actin(CST),低温高速速离心机(德国Eppendorf公司),酶标仪、化学发光仪(美国Thermo公司),曝光机(美国AzureBiosystems公司)。1.2 方法1.2.1 细胞培养与分组293T细胞购买
8、于上海中乔新舟生物公司,使用完全培养基(10%胎牛血清+1%的双抗+高糖培养基)在37、5%C2细胞培养箱传代培养。倒置显微镜下观察细胞,每隔23d传代1次,用含EDTA胰酶消化3min,加两倍体积培养基终止胰酶消化。传代3次后进行实验。分组为1、正常组、ABAD过表达组、正常给药组(Ap.425uMIOUM、20uM)、ABAD过表达给药组(A425uMIOuMs20uM)1.2.2 细胞转染严格按照汉恒LiPOFiter说明书转染。细胞传代3次后,按IxIO5/孔接种,细胞培养箱中培养24h,在细胞密度在60%左右进行转染。ABAD过表达和ABAD干扰转染终浓度为2ug孔。转染5-6h后,
9、更换新的培养基继续培养。24h后,用配制的不同浓度APy2刺激细胞24h1)1.2.3 A阮42的配制AB2母液配制:取人源A2单体,用HFlP重悬,在通风橱中挥发后获得A。肽膜,以DMSO溶解肽膜,稀释至适当浓度后,37孵育48h后即得到AB寡聚体,孵育后的溶液1周内使用。1.2.4 CCCP的配制CeCP母液配制:离心试管,在无菌操作台中称取适量CCCP粉末,加入DMSO,使浓度为20mM,充分震荡混匀离心,即得到CCCP母液,1月内使用。1.2.5 ATP检测按照产品说明书操作,吸除培养液,10OUl裂解液/12孔板每孔,移液器反复吹打,充分裂解细胞。裂解后4C12000g离心5min,
10、吸取的上清即为样品。按照每个样品/标准品需IoOUlATP检测工作液的比例配制适当量的ATP检测工作液。把待用试剂在冰浴上融解。取适量的ATP检测试剂,用ATP检测试剂稀释液稀释ATP检测试剂(1:4)。稀释后的ATP检测试剂即为ATP检测工作液。加IoOUlATP检测工作液到检测管内,室温放置5min。检测管内加上20Ul样品/标准品,迅速用枪混匀,间隔2s后,用化学发光仪测定RLU值。1.2.6 ROS检测按照产品说明书操作,用无血清培养液稀释DCFH-DA(GoOO),使终浓度为10微摩尔/升。用稀释好的DCFH-DA重悬细胞,细胞浓度控制在约一百万至二千万/ml,37细胞培养箱中孵育2
11、0min。隔5min上下颠倒混匀,待探针和细胞充分接触后,用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用流式细胞仪检测荧光的强弱。1.2.7WesternBlot移除培养液,用冰PBS小心洗一遍,按IoOUI裂解液/6孔板每孔的比例加入裂解液,置于摇床冰上,裂解15min,用细胞刮充分刮数下,收集蛋白至EP管。检测细胞浓度(BCA蛋白检测法)。各组样本取相同摩尔质量和体积的蛋白量进行SDS-PAGE电泳(初始电压为60V,待蛋白条带入分离胶,调整电压至IoOV),预先将PDVF膜泡在甲醇液中5-1Omin,待电泳结束,将其转印至PVDF膜,赶走膜和胶之间的气泡,放
12、入转膜槽(100mA,10Omin),IXTBST稀释的5%脱脂牛奶,摇床上常温封闭lh。将一抗和膜置于孵育袋中共同孵育,(一抗稀释液配制所有的一抗,浓度为1:1000),4度摇床过夜。回收一抗,1XTBST洗膜三次,IOmin/次。二抗用IXTBST稀释的5%脱脂牛奶溶解,与膜在摇床上常温孵育lh。IxTBST洗膜三次,1Omin/次。显色及曝光。将归一化后目标蛋白灰度值与内参-actin灰度值之间比值视为目标蛋白相对表达量。1.2.8 统计方法所有实验重复至少3次。用GraPhPadPriSm6.0对实验结果进行统计分析。表中数值均为平均值标准误差(-s)o数据采用单因素方差分析(ANOVA)或者t检验进行分析。P0.05表示差异有统计学意义。2结果1、在293T细胞过表达