造血干细胞表型及分离纯化方法.ppt

《造血干细胞表型及分离纯化方法.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《造血干细胞表型及分离纯化方法.ppt（73页珍藏版）》请在优知文库上搜索。

1、造血干细胞表型及分离纯化方法 一个多世纪前，由 Artur appenheim(18701916)提出。是一类同时具有自我更新和向各系血细胞分化能力的原始细胞群。Hematopoietic Stem Cell支持干细胞存在的初始证支持干细胞存在的初始证据据1.从小鼠独特的染色体标记中证实，存在能同时产生淋巴和髓系细胞的 多能干细胞(pluripotent)。2.慢性髓性白血病同工酶分析可见，B淋巴细胞和髓样细胞都来自慢性 髓性白血病干细胞克隆。3.用带有新霉素抗性基因标志的逆转 录病毒载体转染鼠骨髓细胞，分析 病毒特异聚集部位证实，不同淋巴 和髓系表型的细胞来自同一干细 胞。4.鼠胎肝造血祖细

2、胞体外单细胞培养 可生成髓系和粒系细胞。缺乏辨认、计数干细胞的手段。干细胞的辨认仅靠体外克隆形成分析和估算如：CFU-GM，CFU-Mix。Civin等制备出一株鼠抗人髓系白血病细胞单抗(My-10),当时称KG-la,该抗体可与所有造血前体细胞(progenitors)特异结合。过去干细胞研究进展缓慢的原因过去干细胞研究进展缓慢的原因 之后，其他研究小组也相继研制出12.8;BI-3c5;ICH-3等类似抗体。1986年，这些抗体被命名为CD34，为目前公认的干细胞的重要标志。CD34抗原的发现促进了造血干细胞研究的深入和发展，是一重要的里程碑事件。一.造血细胞的表型 CD34；Sca-1；

3、Thy-1；Lin-；c-kit 二.造血细胞分离方法 FACS；磁柱分离；亲合分离；Panning本次课的主要内容本次课的主要内容一、造血干细胞表型 免疫技术、克隆技术、流式细胞分类术等的发展，促进了干细胞的研究，相继发现许多干细胞特有的表型(phenotype)。如 CD34；Sca-1；Thy-1；Lin；c-kit 等。1.1.CD34的生物学特性的生物学特性（一）（一）CD34 基因定位基因定位 Chromosome 1,(1q32)(human)也有报道位于1q12 q ter 与CD45及一些其它膜蛋白家族毗邻。全长(spans)2628kb(human),编码序列含8个exon

4、s，第1和8个exon 编码翻译区和部分非翻译区；27个exons仅编码翻译区。也有报道人CD34基因全长38kb。基因长度基因长度 在 cytoplasmic domains,人、鼠CD34基因的同源性达90%以上。这种同源性在N末端逐渐减少为45%左右。人、鼠人、鼠CD34基因的同源性基因的同源性 分子量为105-120kd。人CD34 cDNA转录翻译的多肽链长373个氨基酸残基，是一跨膜蛋白。CD34分子的大小分子的大小 N端为20aa的信号肽，含有大量的 serine/threonine；胞外区258aa；跨膜区22aa；胞内区73aa。不同部位不同部位AAAA的长度为：的长度为：所

5、谓表位是指同一抗原分子上有不同的抗原识别位点。目前有My-10,BI-3c5,12.8,ICH-3,TUK,115.2 等单抗识别的位点。前四株识别的表位取决于 sialic acid residues,后二者却不 一样。CD34分子的分子的epitopes （根据对neuraminidase和glycopotease 的敏感性不同）对GPAs敏感，对NAAs敏感性不同 (My-10,BI-3c5,12.8,ICH-3)对GPAs，NAAs都敏感 (TUK3,115.2,8G12)对NAAs不敏感，对GPAs敏感 (QBEND-10)CD34表位分表位分三类三类：许多CD分子既是细胞分化的标志

6、也是功能的标志。CD34分子的确切功能目前尚不完全清楚，但已发现具有以下功能：2.2.CD34的功能的功能(1)(1)粘附功能粘附功能(与与stromal cell 粘附粘附)电镜发现CD34分子浓集在内皮交叉膜(interdigitating membrane)的micro-processes。此部位是白细胞结合并迁移到血管外的重要部位。CD34分子的结构可能影响其与细胞的粘附。此外，淋巴内皮小静脉粘附实验表明，由重组L-selectin识别的一种内皮糖蛋白的硫化碳水化合物，其氨基酸的序列与CD34一致，因此，CD34分子至少可作为L-selectin的配体，协助干细胞与基质细胞接触和粘附。

7、干细胞越原始，表面CD34分子密度越大，细胞分化到形态学发生改变时，表面CD34分子表达逐渐减少，直至消失。推测，在造血早期，CD34分子的作用可能与干细胞之间或干细胞与基质细胞之间的接触、通信和相互作用有关。(2)(2)细胞间接触、通信和相互作用细胞间接触、通信和相互作用 Civin小组证实，CD34可由激活的PKC迅速磷酸化，激活的PKC能刺激CD34阳性前体细胞CD34上调，这种上调独立于内质网内CD34的转录和转换。可见，CD34磷酸化是细胞表面上调的扳机，PKC活化是生长因子配体-受体结合启动胞浆信号转导级联的一个成分。(3)(3)在细胞信号传导中的作用在细胞信号传导中的作用 外周血

8、单核细胞约为0.1%破骨细胞(osteoclasts)、骨髓基质前体 细胞、外周神经鞘细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等也发现有CD34抗原表 达。骨髓单核细胞约为13%。3.3.细胞细胞CD34的表达的表达 一些恶性疾病，如AML、早前，前和急性T淋巴细胞白血病细胞都有CD34抗原的表达。在成人AML中，外周细胞CD34的表达预示患者对系统治疗反应较差，完全缓解率及存活率低，传统的化疗方案治疗效果可能不好。根据细胞表面抗原表达的情况，可将CD34阳性细胞分为许多亚群，这些细胞多数已定向到特定细胞系。与CD34共表达，可作为干细胞进一步分型依据的抗原有：CD38、CD10、CD19、CD5、CD

9、7、CD71、CD45、CD41、CD13、CD33等。4.4.CD34阳性细胞亚群阳性细胞亚群不同不同CD34阳性细胞亚群阳性细胞亚群CD34+CD38-；CD34+CD38+；CD34+CD10+CD19+(前B)；CD34+CD5+CD7+(前T)；CD34+CD71+CD45RO+(红前)；CD34+CD41+(巨前)；CD34+CD13+CD33+CD45RA+(髓前)CD34hi Lin-HLA-DRlow Thy-1+CD45RO+Rhodull .较原始干细胞亚群的免疫表型一般为：(Rhodamine 123 Dull)CD34+CD38-HLA-DR+和CD34+CD38-H

10、LA-DR-两群细胞，前者克隆率为50%，能向所有造血细胞系分化；后者除前者功能外，还能形成复杂的，能支持造血前体细胞分化的基质结构，这种细胞 被命名为Common(hematopoietic/stromal)Stem Cell(CSC)。三色分析又发现三色分析又发现 Osawa等人首先证明小鼠HSCs可以是 CD34阴性的。人的CD34阴性细胞也有低水平的造血能 力。移植研究表明胎绵羊CD34阴性细胞有重 新繁殖的能力。人和鼠的CD34阳性细胞可能来源于 CD34 阴性细胞。CD34是是HSCs标志物近年受到的挑战标志物近年受到的挑战 这些报告提示，HSCs可能是CD34+或CD34-。只选

11、择表达CD34的细胞可能导致将更原始的干细胞排除在外。然而几乎所有的临床和实验流程包括体外培养、基因疗法和HSC抑制，目前都设计成收集富含CD34+的细胞。(二二)干细胞其它免疫表型干细胞其它免疫表型 从前T细胞杂交瘤中得到的几株单抗，由此单抗识别的抗原被命名为Sca-1。是18kDa磷脂酰肌醇锚定蛋白，属Ly-6抗原家族成员。43Sca-1被广泛认为和Ly-6 半抗原一起，是小鼠HSC标志分子，在多能HSCs上表达。1.Stem cell antigen-1(Sca-1)根据Sca-1是否阴性可将Thy-1lowLin-细胞进一步分为：Thy-1lowLin-Sca-1+和Thy-1lowL

12、in-Sca-1-两群，前者含干细胞和CFU-T，后者不含 CFU-T，两群细胞都含CFU-s。mouse 和 rat 骨髓造血干细胞中与淋巴系组细胞定向、分化有关的抗原。2.Thy-1(CD90)一种原癌基因。最近证明造血干细胞与c-kit基因密切相关。c-kit可编码一种穿膜酪氨酸激酶受体分子。应用单克隆抗体证明此分子可存在于造血干细胞膜上，其后证明它的配体分子是造血干细胞因子（stem cell factor,SCF），一种信号传导分子，对造血干细胞的分化具有重要作用。3.c-kit(CD117)c-kit分子可高频率表达于多能干细胞表面,但骨髓中c-kit+细胞可分化为各种血细胞，而胸

13、腺中c-kit细胞可分化为淋巴细胞，不能分化为髓系细胞，所以胸腺内c-kit+细胞，可能是淋巴样干细胞。Lineage negative,指指 T-、B-、M-、G-细胞。细胞。4.Lin-97kDa的糖蛋白，包括5个跨膜结构域，糖基化后在蛋白胶上显示120 kDa的蛋白带。最初是通过AC133单抗鉴定的，它能识别人HSCs的CD34+亚类29,30。一种CD133异构体AC133-2,最近已经被克隆并鉴定为可被AC133抗体识别的原始表面抗原。5.CD133(AC133)Chromosomal Location 4p16.2-p12 human The AC133 antigen is li

14、kely to contain 5-TM domains in addition to a signal peptide.The 5-TM structure includes an extracellular N-terminus,two short intracellular loops,two large extracellular loops and an intracellular C-terminus.Protein Sequence hematopoietic stem and progenitor cells.neural and embryonic stem cells.so

15、me leukemias and brain tumours that may be derived from stem cells.Low level expression could also be detected in the kidney,pancreas,placenta,and fetal liver.ExpressionFMACS-isolated CD133+cells became adherent and CD133-during cultivation,but gave rise to non-adherent CD133+cells budding from the

16、adherent cell surface by a symmetric cell division.Cells were stained with CD133/1(AC133)-PE.CD133-expressing cells in different hematopoietic tissues CD133+%CD34+%CD133+among CD34+cells%Normal bone marrow0.52 0.111.47 0.2336.3 2.2Cord blood 0.16 0.030.37 0.0651.0 1.6Apheresis(采血采血)1.37 0.271.75 0.3175.3 0.8Tree of differentiation 6.ABCG2 (ATP-binding cassette,sub-family G,member 2)Synonyms:ABC15,ABCP,BCRP,BCRP1,BMDP,Breast cancer resistance protein,EST157481,MRX,MXR,MXR1,Placenta-specific ATP-b