碱性磷酸酶AKPALP活性测定试剂盒说明书.docx

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1、碱性磷酸酶(AKPALP)活性测定试剂盒说明书微量法IoOT/48S注意t正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义:AKP/ALP是一种含锌的糖蛋臼衡,在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。AKP/ALP广泛分布于人体各脏器中,以肝脏为主。测定原理:在碱性环境中,AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚;酚与4-氨基安替比林和铁氧化钾反应红色亚醍衍生物,在510nm有特征光吸收;通过测定510nm吸光度增加速率,来计第AKP活性。自备仪器和用品:可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器和蒸谣水。试剂组成和配制:试剂一:液

2、体Xl瓶,4C保存。试剂二:液体Xl瓶,4C避光保存。试剂三:液体Xl瓶,4C避光保存。试剂四:液体Xl瓶,4C避光保存,未变成蓝绿色之前均可使用。标准品:液体xl支(EP管中),2molmL酚标准液,4*C保存。粗*液提取:加入试剂四120L,混匀后于51Onm测定吸光度,记为A测定管。其中标准管和空R管只需做一管,测定管和对照管每个样均需做。注意:空白管和标准管只需测定一次。1.2.3.组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1: 510的比例(建议称取约0.1g组织,加入ImL试剂 一)进行冰浴匀浆,4匕、800Og离心IOmin,取上清液待测。细菌或细胞:按照细菌或细胞数量(IO

3、。个):试剂一体积(mL)为5001000: 1的比例(建议500万 细胞加入ImL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min):然 后8000g, 4C,离心Iomin,取上清置于冰上待测。血液可直接测定,或者适当稀释后测定。测定步骤:1 .分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到510nm,蒸储水调零。2 .试剂三置于37tC水浴中预热30 min。3 .空白管:取EP管,加入4人蒸储水,40L试剂二,40L试剂三, 加入试剂四120L,混匀后于51Onm测定吸光度,记为A空白管。4 .标准管:取EP管,加入4匹标准品,40L试剂二,40L试剂三,

4、加入试剂四120L,混匀后于510nm测定吸光度,记为A标准管。5 .对照管:取EP管,加入L上清液,40L蒸储水,40L试剂三, 加入试剂四120L,混匀后于51Onm测定吸光度,记为A测定管。6 .测定管:取EP管,加入4匹上清液,40L试剂二,40L试剂三,混匀后置于37水浴中保温15min;混匀后置于37水浴中保温15min;混匀后置于37水浴中保温15min;混匀后置于37水浴中保温15min;AKP/ALP活性计算:1 .血液中AKP/ALP活力计算活性单位定义:37中每亳升血液每分钟催化产生lmol酚定义为1个酶活单位。AKP/ALP活力(molminZmL)=C标准品X(A测定

5、管A对照管)(A标准管A空白管)xV反总V样T=6.8(A测定管A对照管)(A标准管-A空白管)2 .组织、细菌或细胞中AKP/ALP活性计算(1)按照蛋白浓度计算活性单位定义:37C中每亳克蛋白每分钟催化产生1mol酚定义为1个醉活单位。AKPALP(molminmgprot)=C标准品X(A测定管-A对照管)11A标准管-A空白管)xV反总(CprxV样)T=6.8x(A测定管-A对照管)(A标准管-A空白管)Cpr(2)按照样本质量计算活性单位定义:37C中每克组织每分钟傕化产生1mol酚定义为1个麻活单位。AKPALP(molming鲜重)=C标准品X(A测定管-A对照管)(A标准管-

6、A空白管)xV反总(WxV样V样总)T=68x(A测定管-A对照管)(A标准管-A空白管)W(3)按照细菌或细胞数量计算活性单位定义:37*C中每IO4个细菌或细胞每分钟催化产生1mol酚定义为1个酶活单位。AKP/ALP(molmin104cell)=C标准品X(A测定管A对照管)(A标准管-A空白管)xV反总(细胞数量XV样V样总)T=6.8(A测定管-A对照管)(A标准管A空白管)细胞数量C标准品:2molmL;V反总:反应体系总体积(mL),205L=0.205mL;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mgmL),需要另外测定,建议使用本公司生产的BCA蛋H质含量测定试剂盒;W:样品质量;V样:加入反应体系中上清液体积(mL),0.004mL;V样总:提取液体积,1mL;T:反应时间(min),15min。注意事项:1.试剂二、试剂三和试剂四均需避光保存。3 .试剂四变蓝绿色后不能再使用。4 .加入试剂四后必须立即混匀,否则显色不完全。

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