2023神经遗传病基因诊断的困境与对策.docx

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1、2023神经遗传病基因诊断的困境与对策摘要随着基因检测技术的日益成熟和检测成本的逐年下降，基因诊断逐渐成为诊断神经遗传病的终极手段。由于神经遗传病具有高度的临床变异性和遗传异质性，临床医生在基因诊断过程中经常面临各种困境。文中针对这些困境提出相应对策，建议神经遗传病领域的专家不仅要熟悉神经遗传病的临床、遗传、致病基因及基因检测技术的特点，从而制定最合理的基因检测方案，还要学会正确分析和解读基因检测结果，避免漏诊和误诊。神经遗传病在孟德尔遗传病中约占60%,种类繁多，表型多样，可单独或同时累及中枢神经、周围神经和肌肉等，部分还可累及心脏、肝脏、肾脏、眼睛、骨关节等其他组织和脏器，如肝豆状核变性(

2、Wilson,sdisease,WD1强直性肌营养不良(myotonicdystrophy,DM)和线粒体病等,具有高度的临床变异性(clinicalvariability),从而增加了临床诊断的难度。随着各种基因检测技术的快速发展和检测成本的大幅度下降，使得基因检测和基因诊断成为精准诊断神经遗传病的终极手段。然而，神经遗传病具有高度的遗传异质性(geneticheterogeneity),具体体现在多个致病基因导致同一种表型和一个致病基因导致多种表型上，而且其临床表型常因致病基因的外显率和表现度不同变得更为复杂。如何制定最合理的基因检测方案？当患者未检出已知基因的致病变异时该如何处理？对检出

3、的基因变异如何判定其致病性？在分析疾病表型时用一元论还是多元论?这些都是临床医生在基因诊断过程中经常面临的困境。文中针对这些困境提出应对策略。一、正确的临床评估是启动基因检测的关键与其他神经系统疾病一样，神经遗传病的临床诊断也是先定位后定性。但临床医生在进行临床评估过程中应关注以下特点从而决定基因检测的必要性：（1）仔细询问起病年龄和进展速度，如婴幼儿、儿童或成人早期起病，起病隐匿且进展缓慢者应进行基因检测。（2）详细询问家族史并绘制家系图，收集家系成员的临床表型，明确遗传模式。有家族史或父母近亲婚配者需进行基因检测；无家族史者仍应警惕隐性遗传或携带新生（denovo）突变，新生突变在婴幼儿或

4、儿童期发生的发育迟滞、智力障碍和先天畸形等遗传发育疾病中扮演了重要角色。（3）认真体检，及时发现对临床诊断有指向性的特殊体征，如角膜K-F环是WD的特殊体征，斧头脸和叩击肌球指向DM鹤腿和猿手则指向腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Toothdisease,CMT对这些患者均应进行基因检测。因此，正确的临床评估是启动基因检测的关键。二、致病基因特点和基因检测技术是制订最佳基因检测方案的钥匙近年来，随着二代测序（nextgenerationsequencing）技术的日熟及测序成本的逐年下降，全外显子组测序（wholeexomesequencing,WES）和全基因组测序（wholege

5、nomesequencing,WGS）已经成为筛查大多数神经遗传病致病基因的首选检测技术，尤其是高深度WGS在分析拷贝数变异(copynumbervariant,CNV结构变异(structurevariation)及核甘酸重复序列扩增等方面亦有不俗的表现11然而，在临床实践中，临床医生通过正确的临床评估了解疾病特点后，应根据其致病基因突变特点和疾病发病率，以及各种基因检测技术的适用范围，给患者制定最合理的基因检测方案。1 .以CNV或大片段重复/缺失为突变特点的致病基因，如SMN.PMP22和Dystrophin分别是脊髓性肌萎缩症、CMT1A和假大型肌营养不良的致病基因，应首选多重连接依赖

6、性探针扩增(multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)技术进行检测。尤其是CMT1A是CMT最常见的类型，临床上遇到CMT患者时，应首先检测PMP22基因。未检出致病变异才进一步选择Sanger测序、WES或WGS进行筛查。2 .以核昔酸重复序列扩增为突变特点的致病基因,如Huntingtin(HTT)和ATXN3是亨廷顿病和脊髓小脑性共济失调3型的致病基因，因重复序列异常扩增次数较少，可首选聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)方法或毛细管电泳技术检测重复序列是否有异常扩增，并采用Sanger测序方法

7、确认重复序列异常扩增次数;而对于重复序列异常扩增次数较多的致病基因,如DMPKxN0TCH2NLCxC9ORF72和NOP56分别是DM1、神经元核内包涵体病、肌萎缩侧索硬化和脊髓小脑性共济失调36型的致病基因,则应首选重复引物PCR(repeat-primedPCR,RP-PCR)检测,必要时采用Southern印迹技术检测。3 .以单核甘酸变异(singlenucleotidevariant,SNV)或小片段插入/缺失为突变特点的致病基因，如ATP7B、PRRT2、NOTCH3分别是WD、发作性运动诱发性运动障碍、伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病的致病基因，应首选Sang

8、er测序或WES检测。尤其是具有众多临床亚型和致病基因的神经遗传病，如遗传性痉挛性截瘫、遗传性共济失调(排查核甘酸重复序列异常扩增后遗传性周围神经病(除了CMT1A1肌张力障碍、肢带型肌营养不良等，应首选WES或WGS进行筛查。若未检出致病变异，再选择MLPA技术进一步筛查易被测序技术漏检的CNV或大片段重复/缺失。当先证者经过上述筛查且经过多人反复分析后仍未检出已知基因的致病变异时，建议采用Trio-WES和Trio-WGS对先证者及其父母进行3人二代测序检测和分析，通过家系筛查进行共分离分析，有助于判读基因变异的致病性和筛出新生突变，从而提高基因诊断的阳性率2,并为寻找新致病基因做出重要贡

9、献。近期发展的基于长读测序(long-readsequencing)的三代测序(thirdgenerationsequencing)技术z在分析CNV,结构变异、核甘酸重复序列及同源假基因等方面比基于短读测序(short-readsequencing)的二代测序技术具有明显的优势3,4,可以提供更高分辨率的基因组图谱，使多核苜酸重复序列扩展突变的研究取得了快速进展。临床上遇到以多核昔酸重复序列扩展为特点的动态突变疾病,尤其是当毛细管电泳、RP-PCR.MLPA及二代测序技术均无法解决问题时，建议采用三代测序技术检测。三、临床表型匹配和基因变异解读是精准诊断的关键要素目前绝大多数临床医生送检患者

10、样品后就等着基因检测公司出具报告，缺乏进一步分析和解读基因检测结果的能力,尤其面对一份包含了意义不明变异（variantsofuncertainsignificance,VUS）或与表型不匹配变异的检测报告时更显得手足无措。以下几个对策有助于高效分析和解读基因检测结果。1 .基因变异筛选：二代测序和三代测序等高通量测序技术均会筛检出大量的基因变异，分析人员首先会根据变异人群频率和变异功能预测结果（即低频有害原则）初筛并过滤掉大量无害的良性变异。UTR区和内含子区变异以及编码区的同义变异，由于功能预测不足，在变异初筛时亦经常被剔除。但有些疾病的致病变异正好位于这些区域，如遗传性脑小血管病的致病基

11、因COL4A1,其致病变异c*32GA位于3,UTR区5,而CMTX1的致病基因GJB1,其致病变异c.-103CT位于5,UTR区60因此，在编码区未筛检出致病变异时，应考虑到致病变异可能位于其他区域或以其他形式（如嵌合体）存在，应再次针对性分析数据，避免漏掉这些致病变异。2 .临床表型匹配：在分析基因检测结果时，基因变异所致疾病的表型必须与患者的临床表型进行正确匹配。分析人员若对患者的核心表型不了解，极易给出错误的基因检测报告，误导临床医生。因此，数据分析人员应与临床医生加强交流和协作，共同完成表型匹配。对于结果阴性病例，应加强患者及家系成员的临床随访，获得更全面的表型谱。临床医生在采集患

12、者的表型后，应按照中文人类表型标准术语词条(TheChineseHumanPhenotypeOntology,CHPO)进行记录,使用CHPO词条提取患者的表型，输入表型匹配软件进行基因相关性排序，协助分析人员进行表型驱动(phenotypedriven)的遗传分析。目前已有多种软件可实现自动化表型匹配，包括Phenolyzer7JkEXOmiSer8和TGex9等。随着时间推移，不断有新的致病基因被发现，基因突变谱和疾病表型谱亦不断得以更新和扩充。及时跟进最新的研究进展，定期重新分析阴性病例的数据，可将基因诊断率提高10%30%10z1103 .致病性质判读：核基因组变异的致病性判读主要参照

13、美国医学遗传学与基因组学学会(AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics)制订的序列变异解读指南12进行，而线粒体基因组变异解读则主要参考线粒体mt-tRNA13和mt-mRNA14变异解读指南。但在临床实践中，我们经常遇到致病性不明确的VUS,此时最简便的方法就是采集家系样品进行家系共分离分析，这是判读VUS致病性最重要的环节。若家系共分离不成功，还需确认家系成员的生物学关系并考虑新生突变或嵌合体现象。在显性遗传家系中，无症状携带者还需确认致病基因的外显率和表现度情况。若还无法确定VUS的致病性，则需利用体外转染细胞系、患者的皮肤成纤维细胞等细胞模

14、型或转基因动物模型进行生物学功能实验从而明确变异的致病性。在分析神经遗传病患者的疾病表型并进行诊断时“缶床医生常纠结于一元论还是多元论尤其在经过上述分析和解读后，患者携带的变异被确认为致病变异，但却无法解释患者所有的临床表型时更容易纠结，此时应想到共病的可能性。1例患者同时患2种遗传病并不罕见15,16,建议重新分析基因检测数据确认患者是否携带另1个致病变异，若未检出，应寻找可能的继发性原因解释患者的临床表型。四、总结与展望随着分子生物学技术的发展以及基因谱和表型谱的不断扩充，基因检测在神经遗传病的精准诊断中无可替代。由于我国对遗传病和罕见病的诊治及研究起步较晚，擅长神经遗传病诊治的专家较为稀缺，临床医生在基因诊断过程中经常面临各种困境。因此，致力于从事神经遗传病诊治和研究的临床医生应接受遗传学理论知识和分子生物学技术的培训I,做到不仅了解各种神经遗传病的临床特点与遗传模式，熟悉致病基因特点及各种基因检测技术的适用范围，据此制订最合理的基因检测方案，还会高效分析与正确解读基因检测结果。此外，应在全国范围内建立数据互通和信息共享的人类遗传资源大数据库，鉴定更多的致病基因，精准诊断更多的遗传病患者。