肝素辅因子II-凝血酶elisa方法说明书.docx

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1、肝素辅因子II-凝血酶elisa方法说明书实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中血清素/血清胺(ST)水平。用纯化的血清素/血清胺(ST)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血清素/血清胺(ST),再与HRP标记的血清素/血清胺(ST)抗体结合，形成抗体-抗原-前标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶S的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血清素/血清胺(SD呈正相关。用酶标仪在45Onnl波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中血清素/血清胺(ST)浓度。标本要求：1 .标本采集后尽早进行提取，提取

2、按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20保存，但应避免反复冻融2 .不能检测含NaN3的样品，因N不3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。样本处理及要求：1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4过夜后于IoOOg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20或-80C保存，但应避免反复冻融。2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8。CIOOOg离心20分钟，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。3. 组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果)，称

3、重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如Ig的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。将匀浆液于500OXg离心50分钟，取上清检测。4. 细胞培养物上清或其它生物标本：10Oog离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。保存条件及有效期：1 .试剂盒保存：；2-80Co2 .有效期：6个月。试剂盒性能：1 .灵敏度：zui小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线

4、性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990o2 .特异性：不与其它细胞因子反应。3 .重复性：板内、板间变异系数均小于10%试剂盒特点：1、高效、灵敏、特异的抗体；2、稳定的重复性和可靠性；3、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体；4、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型；5、节省实验经费。操作步骤：L标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。80pgml5号标准品150u1的原倍标准品加入150u1标准品稀释液40pgml4号标准品150Ul的5号标准品加入150u1标准品稀释液20pgml3号标准品150Ul

5、.的4号标准品加入150U1标准品稀释液10pgml2号标准品150U1的3号标准品加入150U1标准品稀释液5pgml1号标准品150U1的2号标准品加入150U1标准品稀释液2 .加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样501,待测样品孔中先加样品稀释液401,然后再加待测样品IOlU（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3 .温育：用封板膜封板后置37C温育30分钟。4 .配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸储水30倍稀释后备用5 .洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每

6、孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重第5次，拍干。6 .加酶：每孔加入酶标试剂50l,空白孔除外。7 .温育：操作同3。8 .洗涤：操作同5。9 .显色：每孔先加入显色剂A50l,再加入显色剂B50ul,轻轻震荡混匀，37避光显色10分钟.10 .终止：每孔加终止液50ul,终止反应（此时蓝色立转黄色）。IL测定：以空白孔调零，45Onm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将

7、样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。注意事项：1 .试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2 .浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3 .各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4 .请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（XnX5）。5 .封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6 .底物请避光保存。7 .严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8 .所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9 .本试剂不同批号组分不得混用。