分子生物学导论分子生物学研究方法.ppt

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1、1第九章第九章分子生物学研究方法分子生物学研究方法(2)第四节第四节 DNA重组技术重组技术一、目的DNA片段的获得二、载体 （质粒、噬菌体、cos质粒、病毒）三、DNA酶切四、DNA的连接和转化五、重组质粒的筛选和鉴定 1. 质粒DNA的提取 2. 质粒DNA的纯化 3. 重组质粒的筛选和鉴定3DNA重组 DNA重组是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程。又称DNA克隆、分子克隆、基因操作。重组DNA技术史上的主要事件1967年第一次发现DNA连接酶1970年分离了第一种限制性内切核酸

2、酶，发现了反转录酶1972年获得第一个重组DNA分子1973年完成第一例细菌克隆1975-1977年发明了DNA序列测定技术，1977年完成了全长5387bp噬菌体f174基因组测定1978年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素1981年获得转基因小鼠和转基因果蝇1983年获得第一例转基因植物1986年GMO首次在环境中释放1994年第一批基因工程西红柿在美国上市2000年完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定(1.2X108bp)2001年完成第一个人类基因组全序列测定(2.7X109bp)2005年中、美、日科学家联合完成水稻基因组全序列测定5第一个第一个 DNA 重组

3、子重组子 （Paul Berg, 1972）EcoRI recognition sites phage DNAEcoRI cuts DNA into fragmentsSticky endSV40 DNAThe two fragments stick together by base pairingDNA ligaseRecombinant DNA6DNA重组的一般步骤重组的一般步骤1. 从生物有机体基因从生物有机体基因组中，分离出带有目组中，分离出带有目的基因的的基因的DNA片段。片段。2. 将带有目的基因的外源将带有目的基因的外源DNA片段连片段连接到能够自我复制的并具有选择记号接到能够自

4、我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组的载体分子上，形成重组DNA分子。分子。73. 将重组将重组DNA分子转移分子转移到适当的受体细胞（亦到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一称寄主细胞）并与之一起增殖。起增殖。4. 从大量的细胞繁殖群从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重体中，筛选出获得了重组组DNA分子的受体细胞，分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增并筛选出已经得到扩增的目的基因。的目的基因。酶酶 类类功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNA连接酶连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段片段连接成一

5、个连接成一个DNA分子分子DNA聚合酶聚合酶I（大肠杆（大肠杆菌）菌）按按5到到3方向加入新的核苷酸，补平方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口双链中的缺口反转录酶反转录酶按照按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成互补原则合成DNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH末末端（进行末端标记实验或用来进行端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接的连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的3末端加上多聚单核苷酸末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶外切酶III从从DNA链的链的3末端逐个切除单核苷酸末端

6、逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNA外切酶外切酶从从DNA链的链的5末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNA链链5或或3末端的磷酸基团末端的磷酸基团重组重组DNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶10 生物基因组DNA 细胞mRNA反转录合成的单链cDNA 通过机械切割、核酸限制性内切酶消化等处理成适合克隆的DNA小片段 通过PCR技术可以获得目的基因 人工化学直接合成一、目的DNA片段的获得（一）特点 基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞自主复制的DNA分子。二、载体1. 在宿主细胞中有独立的复制和表达

7、的能力，这样才能使外源重组的DNA 片段得以扩增。2. 分子量尽可能小，多拷贝、松驰控制型。3. 能插入较大的外源DNA 片段。4. 载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。5. 载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。12pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindI

8、II (448)PstI (440)SmaI (415)XmaI (413)ApaLI (178)ApaLI (1121)ApaLI (2367)多克隆位点lacZ载体名称载体大小选择性标记基因多克隆位点多克隆位点(multiple cloning sites，MCS) 指多个限制性内指多个限制性内切酶的单一切点。切酶的单一切点。 由许多限制酶切位点组成，往往是人工由许多限制酶切位点组成，往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。序列。 13（二）类型从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为： 克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。DNA 克隆常

9、用的载体有： 质粒载体（plasmid），如PBR322、PUC系列、PGEM 系列和pBluescript（简称pBS）等； 噬菌体载体（phage）； 柯斯质粒载体（cosmid）； 单链DNA 噬菌体载体（ssDNA phage ）； 噬粒载体（phagemid）； 酵母人工染色体（YAC）； 细菌染色体克隆载体（BAC）等。 141. 质粒载体质粒载体 是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb 不不等，为等，为双链、闭环双链、闭环的的DNA 分子，并以分子，并以超螺旋超螺旋状态存在于状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞

10、中，宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有它具有自主复制和转录能力自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。拷贝数，并表达所携带的遗传信息。作为克隆载体的质粒应具备以下特点作为克隆载体的质粒应具备以下特点: 分子量小，稳定存在，较高拷贝数；分子量小，稳定存在，较高拷贝数； 遗传标志；遗传标志； 内切酶点。内切酶点。15（1）pBR322质粒载体质粒载体123来源于来源于pSF2124质质粒转座子粒转座子Tn3的氨的氨苄青霉素抗性基苄青霉素抗性基因（因（ampr）来源于来源于pSC101质粒的四环素质粒的四环素抗性基

11、因抗性基因（tertr）来源于来源于ColE1的派生质粒的派生质粒pMB1的的DNA复制起点（复制起点（ori）16EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r（2）pUC质粒载体质粒载体氨苄青霉素氨苄青霉素抗性基因抗性基因(ampr)大肠杆菌大肠杆菌-半半乳糖酶基因乳糖酶基因(lacZ)的启动子的启动子及其编码及其编码-肽肽链的链的DNA序列序列位于位于lacZ基基

12、因中的靠近因中的靠近5-端的一段端的一段多克隆位点多克隆位点(MCS)区段，区段，它并不破坏它并不破坏该基因的功该基因的功能。能。来自来自pBR322质粒的复制起质粒的复制起点（点（ori）17（3）pMD19-T质粒质粒182. 噬菌体载体噬菌体载体 （1）噬菌体的生物学特性）噬菌体的生物学特性 溶菌周期溶菌周期指噬菌体将指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。(烈性噬菌体只具有

13、烈性噬菌体只具有溶菌生长周期溶菌生长周期) 溶源周期溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。主细胞的分裂而进行复制。(温和噬菌体具有溶源生长温和噬菌体具有溶源生长周期和溶菌生长周期周期和溶菌生长周期)19（2）噬菌体噬菌体A. 生物学特性生物学特性 组成组成：蛋白质外壳蛋白质外壳和和线状线状双链双链DNA分子组成。分子组成。 DNA长度为长度为48502bp，在，在分子两端各有分子两端各有12个碱基的单链个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后

14、，可以迅速通过这主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成两个粘性末端的互补作用形成双链的环形双链的环形DNA分子。上述通分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区过粘性末端互补形成的双链区被称为被称为cos位点位点（cohesive end site）。）。20 温和噬菌体温和噬菌体 一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。周期。 复制复制 溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制; 溶菌周期的早期是溶菌周期的早期是“”复制，晚期进行滚环复制复制，晚期进行滚环复制 基因组成基因组成 DNA至少包括

15、至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约13为非必须区段。为非必须区段。 21B. 类型类型插入型插入型 （Insertion vectors） 这种载体仅仅有一个可供外源这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。插入的克隆位点。 如：如：gt10 、 gt11 克隆能力小，不到克隆能力小，不到10kb置换型置换型 （Replacement vectors） 这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两

16、个位点之间的间的DNA区段是区段是噬菌体的非必需序列，可以被外源插噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的入的DNA取代。取代。 如：如：Charon 4 载体载体 克隆能力大，克隆能力大，2025kb22（3）M13噬茵体噬茵体单链闭合环状噬菌体单链闭合环状噬菌体 只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约长约6.4kb，可分为，可分为10个区和个区和507 bp基因间隔区（基因间隔区（IS区），该区），该区可以接受外源区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能这是该噬菌体能用作单链用作单链DNA载体载体的重要前提。的重要前提。23复制与增殖复制与增殖(1)M13(+)链链DNA进入细胞内部进入细胞内部(2)合成出互补的合成出互补的(-)链链 DNA, 此双链形式此双链形式的的M13 DNA，称为复制型，称为复制型 DNA。(3)按按形式进行几轮复制之后，基因形式进行几轮复制之后，基因 的的产物便在产物便在RF DNA的正链特定位点上的正链特定位点上作切割反应，形成一个缺口。作切割反应，形成一