esVR-2在食管癌细胞中表达及其调控区3′UTR活性的研究.docx

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1、esVR-2在食管癌细胞中表达及其调控区3,UTR活性的探讨陈涛，索彩鼓，吴智勇，嚓连娣，谢剑君，吴健谊，姚晓冬，邹海鹰，王少洪，薛玉洁，许丽艳，李恩民(1.汕头高校医学院生物化学与分子生物学教研室，汕头，515041；2.汕头高校医学院肿瘤病理探讨室，汕头，515041：3.汕头市中心医院肿瘤科，汕头，515031；4.汕头市中心医院病理科，汕头，515041)摘要：目的检测内源性可溶性血管内皮生长因广受体2(endogenoussolublevascularendothelialgrowthfactorreceptor-2,esVR-2)在多种食管癌细胞中的表达状况，克隆esVR-2基因的

2、3-UTR,探讨esVR-2基因3UTR调控报告基因的活性。方法采纳逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)及定量逆转录聚合酷链反应法(qRT-PCR),检测esVR-2在多种食管癌细胞中的mRN的衣达水平；采纳3RACE法克隆esVR-2的3UTR区；采纳双荧光素酪报告基因分析系统，检测esVR-2基因3UTR区调控报告基因表达的实力。结果1)14种食管鳞癌细胞系中的9种，esVR-2的nRNA的表达水平明显低，占64.3%；2)两种食管腺癌细胞系SEGl和SKTG4,esVR-2的nRNA的表达水平，前者明显低，后者明显高:3)5种永生化食管上皮细胞，esVR-2的mRNA的表达水平均明显低：

3、4)与转染空载体PG1.-C的食管癌细胞相比，转染PG1.-C3UTR的食管癌细胞的报告基因荧光素前活性发生显著改变。结论1)永生化食管上皮细胞、多数食管鳞癌细胞和部分食管腺癌细胞，esVR-2的mRNA的表达水平明显低；2)esVR-2基因的3UTR具有调控报告基因表达的活性。关键词：内源性可溶性血管内皮生长因子受体2(esVR-2)：食管癌：调控区3UTR中图分类号:R446.8esVR-2在食管癌细胞中表达及其调控区3UTR活性的探讨#111,32113142251*10152025303540ExpressionofesVR-2inEsophagealSquamousCellCarci

4、nomaCell1.inesandActivityofIts3-UTRCHENTaol,SUOCai-ial,WUZhi-yongl,3,1.IAO1.ian-di2,XIEJian-junl,WUJian-yil,Y0Xiao-dong3,ZOUHai-yingl,WANGShao-hong4,XUEYu-jie2,XU1.i-yan2,1.IEn-minl(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041;2.Departmentofoncopatholog

5、y,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041;3.DepartmentofSurgicalOncology,TheShantouCentralHospital,Shantou515031：4.DepartmentofPathology,TheShantouCentralHospitai,Shantou515031)Abstract:Purpose:Theinvestigationistodetecttheexpressionofendogenoussolublevascularendothelialgrowthfactorreceptor2(e

6、sVR2)inesophagealsquamouscellcareinoma(ESCC),tocloneesVR23UTRandtoexplorethemechanismofregulation.Methods:DetectthemRNAexpressionlevelofesVR2usedReverseTranscriptiOn-PolymeraseChainReaction(RT-PCR)andquantifiedReverseTranscriptionPo1ymeraseChainReaction(qRT-PCR);cloned3UTRofesVR2use3RACE(RapidAmplif

7、icationofcDNEnds);usedDouble1.uciferaseReportGenetodetecttheregulationofesVR23UTR.Results:Ourresultsshowedthat:1)In14samplesofESCC,9ofesVR2mRNAshowalowexpression,thepercentagecomesto64.3%.2)ThelevelofmRNAofcsVR2inSEGlappearancesaremarkablelowexpression,whileSKTG4ishigh.3)TheexpressionsofesVR2mRNAare

8、alllowin5Immortalizedesophagealepithelialcells.4)ComparedwithonlytransfectPG1.-Cvectoraladenocarcinomacel1carcinoma(EACC)cellsandallImmortalizedesophagealepithelialcells,theexpressionofesVR2mRNAshowanobviouslowexpression：2)ThereisaregulationReportGeneactivityinesVR23UTR.Keywords:esVR-2(endogenoussol

9、ublevascularendothelialgrowthfactorreceptor-2);EsophagealCarcinoma;3UTR(3-untranslatedregion)455055可溶性血管内皮生长因子受体-2(endogenoussolublerecoptor-2,esVR-2),以往曾称之为可溶性血管内皮生长因子受体-2(solublevascularendthelialgrowthfactorreceptor-2)是一种分泌性蛋白，能够与血管内皮生长因子VEGF-C(vascular123管腺癌细胞系，以及5种永生化食管上皮细胞系进行了esVR-2的mRN的表达状况进行

10、了研究，与此同时，在克隆esVR-2基因3UTR的基础上，还检测了esVR-2基因3UTR调控报告基因表达的活性。60657075800引言内源性现报道如下。1材料与方法1.l细胞系、质粒与其它试剂食管鳞癌细胞系包括EC1.71、ECI8、EClO9、EC8712、EC9706.KYSE70.KYSE140.KYSEI50、KYSE180.KYSE510、SHEEC、TET、TE-3、COI.0680N,食管腺癌细胞系包括SEGl和SKTG4,永生化食管上皮细胞系包括NEl、NE2、NE3、NECO83、NEC6和SHEE,同时还有肾上皮细胞系293To质粒pESY-BluntSimple(p

11、ESY)购H北京TransGenBiotechnology公司，质粒pGEM-TVeCtOr购自Promega公司，质粒pG1.-C载体购FlPromega公司。TriZol试剂、199培育基、DMEM培育基、GibcoRPMI1640培育基、转染试剂AttraCteneTranSfeetionReagent购HQIAGEN公司。逆转录系统试剂盒(ReverseTranscriptionSystem)、PCRMix、双荧光素酶报告基因分析系统试剂盒(Dual-1.uciferaseReporterssaySystem)购自Promega公司，3RACE试剂盒(3-FullRACECoreSet

12、Ver.2.0)和TaKaRa1.ATaq及限制性内切酶购自TaKaRa公司，TransStartTaqDNPolymerase购自北京TransGenBiotechnology公司，质粒提取试剂盒(EndoFreeplasmidMiniprepKit)购自BIOMIG公司。1.2细胞培育全部细胞均置于37C、5%CO2、饱和湿度的培育箱中培育。食管鳞癌细胞EelO9、EC1.71、EC8712和SHEEC,贴壁生长于含10%灭活小牛血清的199培育液中：食管鳞癌细胞EC9706和食管腺癌细胞SEGl和SKTG4贴壁生长于含10%灭活小牛血清的DMEM培育液中：食管鳞癌-2-细胞KYSE系列和

13、永生化食管上皮细胞系，以及293T细胞贴壁生长于含10%灭活小牛血清的859095100105110115120DMEM培育液中。贴壁细胞培育成单层后，用0.25%的胰蛋白酶(含0.02%EDT)消化，传代培育，每3天传代一次，待达到(12)107数目后收获细胞，细胞密度为(1.01.5)106cells/ml.须要进行瞬时转染试验的细胞，接种子96孔培育板中，每孔1001,细胞接种密度为2105cells/ml,细胞置37C培育，细胞满度约80%90%时，转染质粒。1.3 逆转录聚合酶反应(RT-PCR)Trizol试剂提取细胞总RNA,经逆转录获得CDNA。用于RT-PCR扩增esVR2基

14、因的上下游引物分别是5-AGAGGAGAGAGGGTGATCTC-3和5-CAGAATTGTCTCCCTACCT-3；上游引物特异结合于VEGFR-2的第12和第13外显子，下游引物特异结合于VEGFR-2第13外显子末和第13内含子。RT-PCR的反应条件，95eC5min,950C15s,4830s,72,C30s,循环40次，72C5minPCRMix用于试验，产物长度393bpo1.4 定量逆转录聚合诙反应(qRT-PCR)用于(qRT-PCR)扩增esVR2基因部分序列的上下游引物分别为5-GCCTTGCTCAAGACAGGAG-3和5-CAACTGCCTCTGCACATG-3,上下

15、游分别特异性结合于VEGFR-2基因的第13外显子和第13内含子，扩增序列长104bpo扩增-Actin基因的上下游引物分别为5-CAACTGGGCGACATGGAGAA-3和5-GTAGCAACGTACATGGerGGG-3,上下游引物分别特异性结合于-Actin基因的第3和第4外显子,扩增序列长178bpOPCR反应体系101,反应条件，502min,950C10min,95,C15s,60C45s,循环45次；PCR反应3个平行。以-Actin基因为内参基因，以293T细胞为校准细胞，用2-CT法计算分析。1.5 3UTR的克隆与鉴定Trizol试剂提取食管鳞癌细胞TE-I的总RNA,用

16、3-Ful1RACECoreSetVer.2.0逆转录，在用试剂盒中的引物Inner-primer5-CCTATAGTGAATCACTAGTGGGGTCC-3及其他试剂与另外合成的引物esVR2-F7:5-GGTCCTGTGCGGGCGTTGGTGCCTT-3扩增3UTR,esVR2-F7结合于VEGFR2的原第13外显子和第13内含子,引物最终方框中的三个碱基为终止密码子。依据试剂盒供应的说明书逆转录，再用esVR2-F7和OUte1.Primer（试剂盒供应）及TaKaRa1.Taq进行温度梯度PCR扩增，最终esVR2-F7和Inner-primer进行PCR扩增，反应条件，95C3min,954C30s,64.5*C30s,72*C3mi