DHFR筛选原理.docx

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1、MSX加压筛选与MTX加质筛选击额取业女匡代取(methioninesulfoximine,MSX)论选用的足谷女吊蛇介成附些因(glutaminesynthetase,GS)系统压力；llo(amethopterln,MTX)垢选用的是履叶酸法原的匕囚(GhydrOfoIateredUetase,dhfr)系统乐力.1 .CHO细题玄达体系常用的CHO剂胞系勺两种；CHOfCHO(dhfr-),CHO(dhfr-)W欢失：Mnl酸还冰陶的如联株.CHo表达系统是附应用球广泛的IX核表达系统之一.；其它表达系统相比,它只有很考优点I精册的转戏后假饰功能表达的糖基化药物蛋白在分/结构、理化特性和

2、1曲学功健力而最接近自然城门分f表达产物胞外分泌,使于分别纯化；具有Iiia基因的许效扩增和费达实力:贴堡生长,有牧高的耐受剪切力和涔进压实力，可进行越浮培行或在无血清培行斯中达到高佬度，培育体积能达到100O1.以匕CHo细艇属于成纤维细,也.很少分泌内源点Fl,利于外漱生门的分别纯化,iifiCHO细怛,可更好地表达外源蛋白.为削裁大规模细胤珀H过程中冽亡的发生格bd2基因(细嵬相亡抑制堪因)导入细胞,bd-2延囚的过显表达能抑制Gln或乳说乏引起的蒯胞避亡,削M细胞特定养分成分的消耗，提留顺定度和H的蛋白产质，向CHO利也中分入P21、p27WIM.可使细!UGl期延长(细胞静止,改造后

3、细恂活力正常.邪分成分消耗和代你用新含fi有效降低.从而削M细瞅词亡、死亡,外海俄白衣达狄提高.产品成本降低.2 .找体系统借助口核塞因表达司控的理论,可将校强的成式作用元件袋中到个找体中,使其便利囱效地表达外源基因，目前，己姓构建r很多反核表达故体，它们包含透明的般式作用元件和选抒标记。顺式拈用元件主吸勺启动子一增加子元件、转录剪切和POtyA信号等ICHo细炮发达枕体中上婴行两类选择标记：非犷增她因和共扩增基因.2后动子和培加子启动于是子响外源基因衣达效率的关键因素.作为表达我体元件之,启动子班需强的转生活性，又应兵法较广的通用范附.加丽的主长启动干和增加子在动物如眩中不起作用，所以大多从

4、启动效率1Il生物背加二版的IW拆珞囚,中分别得到.SV40.1.TR和CMVH动子在CHo细胞中效果良好.仃探讨表明：在CHO细悒中.CMV启动子的转录活性分别是SV40启动ff(；1.TR启动子的10倍和30fflr.来浓J理曲体的一些启动子,1T7启动子也可用于动物细用.除f病,*来泡的启动九现在热爱于我：?刖胞内汨性的启动子，如肽健延长因广珞因的启动子(EF-lX鸡抱浆B机动蛋白H动子等.EFToH动子是迄今应用中双强的后动子之、11前陶业化的表达欣体中t妾运用SV40,CMV和EF-Io启动子.外源星因在吨乳动物细胞中的衣达受很多因素的影响，如转录水平、转录后处理、髭译水平以及蜴评后

5、加工等方面,其中尤以朴戏水平的词祭最为更耍.在如姒中转或水平的词控是由M因的既1式作用元件与刖胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现,由于在特定的细胞内,反式作用因子是固定的，不行变更的,因此堪囚的友达主要取决于共顺式作用元件的作用.对外源基因而FG也就是确定于特定的表达软体中的启动了.个合适的E；动子可将外海塞的表达水平梃穿儿倍黄兔儿I,倍.但是对于特定的延因和细胞，各后动f起始转录的效率力次大的浆别，因此我们认为在进行外源病因的表达探讨中，应考虑选川几种不同的强埒动子,才4 .衣达克隆的筛选不同的细瞅克隆.外源蛋白波达水平凹凸不同,缘由可能有二方面,-是外海湎粒片段络合入细胞染色体的位

6、置不mj彳i的区域转录活件1fi的转录活性低：.足不同的细胞克泽侦粒的博贝数是不同的.选择商表达的不克隆细胞株皎果纳两种流理：德和方案首先通过依总外海桂因的衣让，逐一与选dhfr阳性巧克碳,再转到浓度排埃上升的MTX之下生长,分别进行扩增I另一种方法先把dh的阳性单克隆合并,在不断上升的MTX之下加压扩增外力珞因的表达.般券携出稳定的、岛表达的通克隆细胞株.加乐及墙外海基因表达,段了单纯运用dhfr扩增系统或GSIf增系统外.也可采纳G418t;MTXiIVHFIIMia!.G418与MSXImethioninesulphoximine,GS抑舸彷）联合作lliWH.或并利用dhfr扩增系统、

7、GS于增系统共加压，混合克球的友达水平近赶不上表达竹高的整个克降,这是因为转型的CHO细电中存在不表达喊低表达的二牛产细胞.并可在K期生存.U至MTX加乐时占生长优势,可斥我它高上达细阻.成为细胞群体中的主要部分导致产低严峻下降.并对MTX加压无反应.节撤除MTX,会发生外源Si白表达欹下降的状况,缘由也可能在此.5 .工程Iffl胞大规模培百细胞焙仃是现代生物学探讨中应用最为J泛的技术之。它的突出优点，能探讨对象是活的彻胞，可长时期坳藻控.依测M至定明评估其形态.结构和生命活动1%:及可以人为地严格限制探讨条件，使干探讨各种物理、化学.生物等外界因索对细化生长.发育利分化等的杉响,有利于单因

8、孑分析；三是探讨的村人，:以让丹比旌均Tt.常用的细胞齐均的捌驰，须要时还可采讷克隆化等方法使细胞斑一步纯化；四是探讨的内容便于视察、曲测和记杂,体外培育的细眼可采纳晶微镜,电镜等胱视察记录,充分清政试验的要求.另外还具行探讨池出比较广泛,探讨费用相对经济等优点.然前细胞培育也有其用取性.由于珀什的细胞脱火了机体困用的环境条件,H细悒形态和功能都会发生泞定程度的变更.尤其是体外反H传代、长期培ff的细也，行可健发生染色体止倍体变更等状况，Wi1.,应将体外培行的细胞视为一种既保持动物体内除加刖.肯定的性状乂共口某些变里的特定的细胞群体.由于堆胞培育技术的优点足共他试验方法和技术所不能比拟的,所

9、以近年来细照用百技术在分了生物学、细照生物学遗传学、老年学免疫学种埔学和病出学等很多融域都得到广泛的应用，或中对于分f生物学家及细胞生物学家而,应用细也培育对感爱好的基因产沏进行定位、运动及功能探讨变得题东也展晓，在克隆一个蜃因后的下iP,往往是将其导入不同类型细也，以分析其衣达.测定农达对细胞生长的影响,城将离滋达的基因产物纯化.5.1 fi利用含清格百站生产蛋白IVl,有很多不利，如埴加培百成本和污染机会增加纯化煦度和成本，增加产品施控指标.因此,大规模生产临床运用的生物制品，应尽Jft削M血清的用用,最好用无血清培育茶取代，为此，应尽可能增加大规模细胞格行的接神蜜硬，以缩血生长延滞期,提

10、高细胞比生长速率.作加接种率度较低时,在用育起先阶段,可运用含血清培育基.待细咆变质达到肯定浓度（如A106ml）.细跑进入对数生长期.再降低业清浓度或运用无血清培育琏.外源蛋白的实际产也无用心下降.很多试吩表明，细也的比生长速度相对保低时,产物的比生长速率提高，缘由可能是用于刖胞增殖的能质削出有利于外源果白的生产，运用无血清格什基代替含血清增疗珞，可克服血清带来的笄州,IH失去血消中的促细肥生长因子,细胞生长减慢,宓度簿低,生存周期缩短.导致批白产破卜降.因此往往通过增加无血清培育塔中的养分物物以优化细胞培育提岛蛋白衣达.用作血清件代成份的种类很多,大效可分为澈素和生长因子、结合3门、咕型和

11、扩展因子及低分fM岸分因子四类有热时报道，添加BSA对促进细胞生长作用显芬,内Si酸地、楣胺、酸钠有利于表达H的产物。不同的CHoI：程细帼的指门战添加成份可证存在茅界.-殷须耍门已迸行投索被优条件.5.2 辄气和戈化碳殷认为动物细艇培育的相H溶淡在10%60%之间.过岛可投伤细眦朕林至DNA.从而导致细胞死亡.而溶氧过低又会变更细胞的代幽,降好细胞蛋白衣达水平甚至因缺依而呼效细胞渐激死亡.胡显文等在利用多孔做找体大规KUSffCHO细胞时发觉，溶就谁持在20%45%时,而细胞历达产物和解期糖代谢无明显影响,奥溶氧降至7%9%时，细则表达水平明显降低,前糖代津转化为乳酸的比例上升，培力基的仃效

12、利用率明显降低.他首细胞培。规校和密度的增大，可导致C02枳米.从而对细胞产生般性作用或者变更细胞代谢水平.CHe)细胞大规模培仔的上曲反应器中,技动C02水平为4%10%J让到14%时便会见拗胞生长疝C02分压使出处CHO剂胞系的生长和俎织中纤溶曲除微活flJ(t-PA)产率均受到抑制，而I1.t-PA时缸中包含N-羟乙限神经纸酸的Wift酸比例料下降.5.3 5和乳酸找和孔酸足细胞培。过程中的1.要代啡硝产Mj孔酸相比,53浓度的气就会对束组CHO细料产生明U的抑刖作用,最终的细胞淞哎刚匕发浓度的处届而曲低-次来源IlWifii三是干施来源于培育袍.是细胞代谢产生.:齐都涉及谷虹酸胺，因此

13、须要防止培行花中Gln门然分解，限制GIn用汽，并层St去培fitt中的基。乳喂是细服糖代谢的产物.高浓慢的乳喉也会抑制细他的生长。气用乳酸对细胞的毒性作用在多种不同的细胞系均存在,不同细例系对于这两种代谢产物的耐受性差别很大缥由可像是不问细胞系的劲船和谷亚酰胺代谢过程中关彼阱的政感性不同或由在不良的生长环境下,丘亚酸代谢发生变更.由于GIn和葡Sne代谢的相互影响，因此际低培TfG中德Sii糖浓度以及削诚乳酸产生的同时，必需平葡葡期植和Gln的比例.6 .问题和慰电外源米白在CHO细胞中非达的影响因索特别困难，让立检定、高效表达的甲组CHO细帼系并非同功.目前主要存在问题如下：里组CHO细胞

14、生产效率低:某些簿基化表达产捌不柩定.不易纯化：发坦CHo蒯腿上游构建与下游分别姓化脱忙主要表现为上游构建时苓氐考虑它的育效表达，而对产沏的分别纯化过程学也较少；雌组细胞培ff冼用品击，门动化水平低下。小现货白在CHo细抱中高效农达必个涉及多学科的同题.而多个探讨领域的共同合作探讨,科研人员可能纪以下问虺作为今后的主攻方向：梃商衣达水平加找寻我新的强后动f和介适的增加了、在我体上装配适合眼因高效表达的必要元件、依据CHO细胞随评特点，调整外源韭因密码子等；注点分别纯化的问题，如变史DNA中的个别序列，使表达产物在不影响生物活性的前提R携帝右利广分别纯化的茶因I细胞培育的低成本、晶本唆*岛产号和

15、培育设备的大型化,自动化、精致化I分别纯化的低成本和海活性回收率等方面.探讨有些自然的舁花牛.物活住的蛋门类物I百,在人类疾物的治疗中发挥希巨大的”用“做是这些活性物质,有些在自然界中畲量很少,涵意不了人们的须要：有理畲异源蛋白太多,纯化如收大等映点,施的T程药物的产生解决了这些贬曲义行跨时代的.意义是生.物技术水平发展的亚要标记之一，咀生缶白坛药物具有活性高、用依少.身于规模化生产等优出，足用内外生拗药物开发的成点.细跑表达温送白Ai收整的是登保持Jt自然结构及活性，而早期的除核表达系统不能分泌付活性的蛋白.部是以内涵体的形式存在的.也核表达系统因为艮疗转录后的凭饰加工功能,包括货白折冷.依

16、位形成、变地多聚化、肚集裂解、:白磷酸化以及N型和O室枪摄化等.因而在达的用组张门在结构和功能方面更接近于自然的蛋臼分八尺行生物活性”J分泌也外.CHO细胞是外激战白表达运用得较为胜利的朝孔动物细胞，K用于外海范因表达也具有很多优点，如外源拓因能铭靶定整合于细也染色体内，易于规模化培仃笄。由于CHO-dhfr-细胞自身缺失:氢叶酸旗酒(dhfr),无，自身合成四小叫酸,所以必H在添加了次黄嚓岭(hypoxanthine),!i(ThymIdIne)和甘氨酸的培存液中才俺得以存活.而通过目的些因与dhfr基因共转染,不仅得到在不畲上述语加剂的珞育基上也能生长的细胞克隆,更为名要的是由Fdhfr可被叶酸类似物MTX所抑制，在MTX浓度选择压力下,dhfr茶因必需扩增到做多的拷贝数才能生存,从而得到抗MTX细胞票I又由于ndhfr