菌种保藏大全.docx

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1、菌种保藏一、菌种的含义：菌种：菌种是指食用菌、工业菌、农用菌菌丝及其生长基用组成的繁殖材料.分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级，也可以理解为保存着的、具有活性的菌株。微生物工业对菌种的要求1.原料廉价,生长迅速、目标产物高。2 .易于控制培养条件,酶活性高,发醉周期较短，3 .抗杂菌和以菌体的能力强。4 .菌种遗传性能稳定,不易变化和退化,不产生任何有害的生物活性物质和毒素,保证安全生产。5.对放大设备的适应强。二、诏种保藏的重要意义：菌种是从事微生物学以及生命科学研究的庭本材料,特别是利用微生物进行有关生产，如抗生素、氨基酸、酸造等工业,都离不开菌种，所以菌种保藏是进行

2、微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不死亡,同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来,而不致向坏的方面转化。菌种是一种极其重要和珍优的生物资源，1980年我国成立了中国微生物菌种保藏委员会.苗种保藏的原理与方法微生物菌种保藏的概念:收集实验室和生产用微生物(菌种、菌株、病毒毒株等，也包括动、植物的细胞株和微生物痂粒)，运用适当方法和措施使其长期存活并保持原种的生物学性状稳定不变,使之不死、不衰、不乱，以达到便于研究,交换和使用等目的的措施。微生物个体微小、代谢活跃、生长繁殖快,很容易发生变异,或被其他微生物污染,甚至死亡.因此根据实际情况选择合适的保藏方法卜分里要.

3、一、菌种保藏的原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创条件使其生长代谢处于最低或几乎停止的状态，以减少其变异和保持生物性状“保敏时,i股利用菌种的休眠体(他子、芽饱等)，创造最有利于休眠状态的环境条件,如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏苜养物质等，以降低菌种的代谢活动,减少菌种变异,使菌种处于“休眠”状态,抑制其繁殖能力,达到长期保存的目的.一个好的菌种保藏方法,应能保持原菌种的优n特性和较高的存活率,同时也应考虑到方法本身的经济、简便。国内外主要菌种保就机构介绍国外(I)ATCC美国标准菌种收藏所,美国，马里兰州，罗克维尔市.(2)CSH冷泉港研窕室,美国.(3) IFO日本大阪

4、发醉研究所，日本大阪.(4)NRR1.美国北部地区研究实脸会(5)CBS荷兰毒菌中心保藏所(6)NCTC英国国家典型菌种保藏所现有菌种保藏的大体方法有1 .传代培养法2 .悬液法3 .教体法4 .真空干燥法5 .冷冻法菌种保藏的注意事项(1)雨种保藏所处的状态大部分以均保敝其休眠休,保敏前选择合适的培养时间。培养时间过长,生产性能会卜降,反之保存时容易死亡。一般以稍低于生长最适温度培养至剂子成熟保藏的菌种进行保藏,效果较好.(2)保做所用的基质一般使其营养成份贫乏较好,降低其代谢活动。冷冻时应加入保护剂。(3)操作过程尽垃减少对细胞结构的损害,如选择合适的冻结速度,加入保护剂等。细胞结构的损伤

5、不仅使菌种保藏的死亡率增加,而且容易导致菌种变异,造成菌种性能衰退，二、实验室和生产实践中常用的两种保藏技术方法:斜面低温保藏法（冰箱保藏法）2 .矿物油中浸没保藏法3 .穿刺法-1.滤纸法5 .固体曲保藏法6 .砂土管保藏法7 .普通冷冻保藏8 .超低温冷冻保藏法9 .冷冻干燥法10 .液氮冷冻保藏法11 .寄主保藏保政方法通常基于温度、水分、通气、营养成分和渗透压等方面考虑1,斜面低温保敏（冰箱保藏法原理是利用低温（41）降低菌种的新陈代谢,使菌种的特性在短时期内保持不方法是:将菌种转接在适在的固体培养基斜面上,将其充分生长好后,用封口膜或油纸将棉塞部分包扎好，置于4C冰箱中保存。斜面法保

6、藏菌种的时间依微生物的种类不同而异.卷菌、放线菌以及形成芽泡的细菌保存3、5个月移种一次,普通细菌最好每月移种一次.假单胞菌则两周传代一次,酵母菌间隔2个月。注意事项1 .保存期间要注意冰箱的温度,不可波动太大，不能在Oc以下保存,否则培养基会结冰脱水,造成菌种性能衰退或死亡.2 .此方法是一种短期、过渡的保藏方法此方法,一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏,一般保存时间为3、6个月。优缺点优点:最为简单和经济,搽作简单、使用方便、不需要特殊设备,能随时检套所保藏的菌株是否死亡、变异、与污染杂施等。可用于实验室中若干菌种的保藏。缺点:保藏时间短、需定期传代,且易被污染，菌种的主要特性容易改变.易

7、发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变3 .矿物油中浸没保谨（石蜡油封藏法）1 .先将液体石蜡分装于试管或三角瓶中，塞上棉塞并用牛皮纸包扎.121C灭菌30min,然后放在40温箱中使水汽蒸发后备用。2 .将需要保藏的菌种在最适易的斜面培养基中培养,直到菌体健壮或胞子成熟.3 .用无菌吸管取适量的无菌液体石蜡,加在已长好的菌苔的斜面匕其用量以高出斜面顶端Icm为准,使菌种与空气隔绝。4 .将试管直立,置于低温或室温下保存（布的微生物花室温下比在冰箱中保存的时间要长）。此法实用效果校好。产例子的毒前、放线菌、芽胞菌可保藏2年以上,有些酵母菌可保藏2年,一般无芽泡细菌也可保藏1年左右,甚至用一般方法很

8、难保藏的脑腺炎球甑在37七温箱内，亦可保存3个月之久。注意事项1以液体石蜡作为保藏方法时,应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还卜分明显,有些菌株如某些假丝酹母还会同化液体石蜡,也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保做。为预防不测,一般保藏株23年也应做一次存活试验。5 .从液体石蜡卜面取培养物移种后接种环在火焰上灼烧时,培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅,应特别注意，尤其是保藏致病菌更需小心“优缺点：优点:制作简单,不需特殊装备,且不需经常移种。缺点:保存时必须直立放置,所占位置较大;同时也不便携带，6 .穿剌法该方法比较简便,是短期保藏苗种的种有效方法

9、.1 .接种培养（培养试管选用带螺旋幅的短试管或离心管）。2 .将培养好的穿刺管盖紧,外面用封口膜封严，置于于4C存放.3.取用时将接种环（环的直往尽量小些）伸入菌种生长处挑取少许细胞,接入适当培养基中，将穿剌管封严后可保存以后再用。4.沙纸法1、灌纸的制备将港纸剪成O.5cm1.2cm的小纸条装入0.6cm8cm的安幽管中,每管装入2片,用棉花塞上后经121C灭菌30min.2、保护剂的制备配制20%脱脂奶,装在三角瓶或试管中U2C灭菌25min.待冷却后随机取出几份分别置28C、37C培养过夜,然后各取O.2ml.涂布在肉汤平板上或斜面上进行无菌检查,确认无菌后方可使用,其余的保护剂置IC

10、存放待用。3、菌种培养将需保藏的菌种在适宜的斜面培养基上培养，直到其生长丰满。4、菌悬液的制备取无菌脱脂奶2-3m1.加入待保存的菌种斜面试管内，用接种环轻轻地将菌苔刮下,经振荡涔筮荡均匀，即为菌悬液。5、分奘样品:用无菌滴管或吸管吸取菌恐液滴在安嘏瓶中的港纸上,每片港纸滴O.5nl.塞上棉花“6、干燥:将安髓管中放入五氧化二磷或无水氯化钙作吸水剂的干燥瓶中，用真空泵抽其至千。7、熔封与保存:用火焰将安瓶管封口，置于4C或室温存放,8、需耍使用菌科1.豆活培养时,可将安瓶管口在火焰上烧热,滴一滴冷水在烧热的部位,使玻璃破裂，再用镶子破掉口端的玻璃,待安瓶管开启后,取出泄纸,放入液体培养基内，置

11、温箱中培养。细菌,酵母菌、丝状其的均可用此法保藏,前两者可保藏2年左右,有些丝状真菌甚至可保藏1417年之久.此法较液氮、冷冻干燥法简便,不需要特殊设答.5 .固体曲保藏法这是根据我国传统制曲原理加以改进的一种方法,适用于产电子的真菌.该法采用纸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产抱子培养基,使菌种产生大量的体眠体（抱子）后加以保存。该法的要点是控制适当的水分。6 .砂土管保藏法本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于产泡子的放线菌、霉菌以及产芽抱的细菌.砂土是砂和土的混含物.砂和土的比例一般为3:2或1:1.（D取河沙加入10%稀盐酸,加热煮沸30分钟，以去除共中的有机质“倒去酸

12、水,用自来水冲洗至中性,最后一次用蒸馅水冲洗。烘干,用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒,备用。（2）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土,加自来水浸泡洗涤数次,直至中性“恢干,搬碎,通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒.（3）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例,甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入IOmmX100mm的小试管或安能管中,每管装Ig左右，塞上棉塞,进行灭菌（通常采用间歇灭苗23次），烘干。（4）抽样进行无菌检查,每10支沙土管抽一支,将沙土倒入肉汤培养基中,37C培养48小时，若仍有杂菌,则需全部重新灭菌,再作无菌试验,直至证明无菌,方可备用。（5）选择培养成熟的（

13、一般指电子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种,加入23m1.无菌水,用接种环轻轻地将菌苔洗下,制成抱子恐液.（6）于每支沙土管中加入约0.5ml（一股以刚刚使沙土润湿为立）他子悬液，以接种针拌匀.7放入真空干燥器内,用真空泵抽干水分。每10支抽取一支,用接种环取出少数沙粒,接种于斜面培养基上,进行培养,观察生长情况和彳j无杂菌生长,如出现杂菌或前落数很少或根本不仁则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检杳。若经检杳没有间彩,用火焰熔封管口（也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口），放冰箱GIC）或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况.（8）需要使用菌种，比活培养时,取沙土少许移入液

14、体培养基内，置温箱中培养。此法多用于能产生泡子的微生物如存菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好,可保存2年左右,但对于营养细胞效果不佳。7 .普通冷冻保就由于该法的保藏温度为-20C,为了避免微生物受损伤致死,需要甘油作为保护剂。甘油的最终浓度为25乐具体操作如F：配制浓度为50%的甘油溶液，121C灭菌后备用:制备曲悬液,一般的悬液的浓度为1081010个八也：将阑悬液和Il.油溶液以等体积混合均匀后,置-20C保藏，或者,将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上,待生长适度后,将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存.普通冷冻保藏可以维持若干微生物的活力1、2年。应注意的

15、是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保敏。保做过程中应注意控制保减温度,培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行,但不适宜多数微生物的长期保藏。8 .超低温冷冻保敏要求长期保藏的微生物菌种,一般都要求在-60-8(C以下进行保藏.在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1 .离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞2 .用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3 .加入等体积的20%甘油或10%二甲亚IW;4 .混匀后分装入冷冻指管或安酿中，于YOC超低温冰箱中保就“如果特保做菌种牛.长在斜面上,则可用含IOMI.油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在12aCmin.若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响.其基本原理是在较低的温度下(T8tC),快速地将细胞冻结,并且保持细胞完整,然后在真空中使水分升华.这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平,不易发生变异或死亡,因而能长期保存：,一般为510年.此法适用于各种微生物.具体的做法是先将做生物制成悬浮液,与保护剂(一般为蔗犍、脱脂牛奶或曲洁等)混合,放在安甑管内，用低温酒精或干冰(-15C以下)使之速冻,在低温下用真空泵抽干,最后将安液管真空熔封,低