流行性出血热血清学、病原学诊断方法、病原学、临床及流行病学资料.docx

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1、附录A（规葩性）流行性出血热血清学诊断方法A.1I理摘获ElJSA法（MacE1.ISA）检测流行性出血热IRM抗体A.1.1原理根据抗原抗体特异性结合的原理.利用抗人U疑特异性抗体捕获待检测血清中的EM抗体.加入的标病毒蛋白抗原，也可加入病毒蛋Fl抗原或灭活病毒与相应的图标特弁性抗体,反应后加底物显色或发光。显色程度或发光强度与特异性IgM抗体含量型正相关。A.1.2标记抗原法A.1.2.1材料和试剂材料与试剂如卜，可根据所选用试剂盒的不同有所增诚。a）洗板机、解标仪、恒海骅箱或水浴希（372Cb）101.-200U1.可调移液零、IOm1.吸管.c）植祥血清用的试管、吸水纸.d）然憎水或去

2、离子水，e）洗液（PBS-T：磷酸皓缓冲液,含0.05%吐温20,pH7.2,f）流行性出血热I弱抗体捕获E1.ISR渗断试剂盒。A.1.2.2检测步骤应参考所选用试剂盒说明书进行相关检测，检泅步骤如F.a）将阴、阳性对照血清.待检1批的Il梯择液按1:K）Cl稀择.加入已包被抗人U燧抗体的胸标板中.1001.fl4,置37C孵育1h.同时设空白对照.b）弃去上清，用PBS-T理洗5遍.C）将适当稀柞的科标记的病毒抗原加入反应板相应孔内，100H1./孔，37C羽有1h.创他与阴性对照孔仆OD值处于预测危围，PN2.1,对照成立：若待检血清孔Oim与阴性对照孔OD值比值32.1,则标本为流行性

3、出血热IgM抗体阳性,反之阴性，,实时荧光定It逆转录聚合曲链式反应（quantitativeReal-tieRT-PCR,qRT-PCR）、翳因测序或其他经过评估合格的病毒基因加核酸检测方法进行检测，检出特异性病毒核酸具有确诊意义8.1流行性出血热痛雷RTfCR法核酸检测8. 1.1原理PCR技术是在特异性引物存在的条件下，利用双链DNR分子破玳配时原则，在体外扩增DNA片段，其特异性取决于界核甘酸引物的序列，引物与待扩增片段两条琏西段DNA序列分别互补结合后，在DNA聚合解催化下.引导引物的5端向3端方向延伸合成新融.是温度控制下可重复进行的热变性、更性延伸的温控循环过程,可使DNA产股呈

4、指数上升.汉坦病毒为负性RM病毒,PCR扩增检测前需经过逆转录前作用，合成第一条CDM链,再进行PCR扩增,呻RT-PCR.设计不同特弁性引物可犷增不同种汉坦病毒基因。从患者标本中提取衲毒法因俎RN,利用适当方法进行核酸检测，可通过扩增片段大小赛定、基因如序列比对分析、特异性引物探针序列等方式，达到就原体鉴定和基因分鞭目的。B.1.2试验材料材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增M,a）急性期患者血标本或分岗的汉坦病毒：b）RNA提取试剂盒：c）汉坦病毒核酸扩增引物及分型引物（表B.1）：d）逆传录与PCR扩增试剂食.e）砂液器（10U20M1.100u1.200u1.10001.及配

5、套吸头、PCR反应管、离心管（1.5m1.）及管架、台式高速小心机、普通冰箱、旋涡混合潺、PCR扩增仪等。表&1流行性出血热病毒RT-PeR法核酸检测及基因分型参考引物序列引物名称引物序列（5,-3）片段大小型别HantaV5-GGAeCTGGTGCCKrTGTGAACC-349ObD通用IIiinliiSK5-ACCICCAACGVTGAA(X3IITXG1I5TGCAAoGGGGAGAGGAAMT-3242bp汉港IirxClR5,YTAcrGATmAarTATCTCTSEX11F5*-TG1AATGGTCAGAAGK-3287bp苜尔SEOGlR5CGTAG1UTGGCrnGftATCG

6、Gn3,8. 1.3桧测步艰应参照所选用试剂盒说明书进行相关检测,参考步骤如下.a）病毒RA的提取：按试剂说明书操作，制备模板RNA.b）逆转录合成CDNA：可用防见引物或病毒特界性引物，按商业化逆转录酬说明书进行，c）PCR扩增：根据实脸室内所使用杭华核酸PCR扩增试剂盒特点，通用型正、反向引物配置第一轮PCR体系，进行第一轮PCR扩增.推荐反应条件为94C预变性2min.然后94C变性30s,55TC退火30s.72C延伸1ai11.反应40循环.最后72C延伸10min.第二轮分型PCR扩增体系航置采用分型正向引物与a）病毒RNA的提取：按试剂说明书操作，制法模板Rb）实时荧光RT-PC

7、R扩增：实时荧光定量RT-PCR扩增反应配附体系，参考如下；RNA模板5M1.,酰0.5Jl1.缓冲液12.5u1.引物各0.5JI1.供2对,4条,浓度为20D,探针各0.25U1.加水至总体枳25u1.推荐反应条件为50C30min.95X?2min.95C15s.60C30S反应40个循环.具体反应体系可根据所使用的试剂和荧光PCR仪器进行优化隅整.82.4结果判断以灵光PCR反应的前3个15个循环的荧光信号作为本底信号以本底信号标准差的10倍作为荧光阈伯，标本扩增产生的优光信号达到荧光网值时所对应的循环数为循环阈值Ctft）.以C38可判断为阴性，CI伯处于3538之间者，可判断为灰区

8、，管采用另一套引物探针或其他检测方法进行检测判断8. 2.5意义排除污染后，检出病毒核酸可确诊汉坦病毒整鎏，用于早期诊断，阴性结果不能排除衲毒感染.83病毒分离8. 3.1原理韧毒不能独立生存，需依赖宿主细府完成白我发制.VeroE6和Yero细胞时汉坦病毒敏感，可用于汉坦韧毒的分离、培养，一股不产生显著病变，可通过观察细胞.内和培养上游中，衲毒蛋白抗原和核酸的变化情况,检粉病毒的存在和鞭别.汉坦病毒的分离培养需在生物安全二级或以上娘别实脸室内进行.B. 3.2试验材料材料与试剂如下,可根据所在实验室的习惯与规程有所增诚。a） 101.-2001.1ml.移液零、无雨吸头.b） 96孔、24孔

9、组织培养板或T25细胞培养就或细胞培养管.c） VeroE6细胭或其他敏感细胞.Ver。E6细胞一般较其他细胞敏感.d） CG培养箱、生物安全柜、倒芮显微镜。e）细府生长液、维持液与Hanks液。f）患者血标本或宿主动物标本.无曲采集发病后5d内静脉血3m1.,置冰点中，于实脸室中分围血清,接种细胞培养：不能及时接种细胞在可置701C保存.污染的血清要先用双抗（能及素、链寄素.最终浓度各500000U三l.）.C2h处理后接种细胞.B3.3实验步骤可根据所在实验室的规程有所调整.具体步骤参考如下：a）样本处理和稀糅：忠者急性期血清标本适当稀择后（如1:10、1:20等）可直接用于病毒分离.在病

10、毒细胞培养分离设置一个正常人血清同样比例曾择作为阴性对照.b）细府接种：将培养好的Vero-E6或Yer。单层细咆上清充抖，JWlankS液洗涤2遍，HJHankS液1:10确律的早期血清乐本0.5m1.lml.接种T25细胞培养瓶中长成单层的细胞，在37C温箱吸网2h后用无菌HankS洗涤细胞层12次.每次5ml.,蜃后加入维持液5ml.37C培养.每隔3d4d换培养液.c）培养至第K）d-14d刮取少Ift细胞点抗原片进行免役荧光检测.如果荧光检测阳性,则收集上消接种新解细胞进行病毒培养，确定病毒型别：如果检测结果仍为阴性，则收集培养液,冰存于-7（TC或液氨中以备重新检测，细胞需继续传代

11、。1）连续传代：用腆的消化以上步骤中检测为阴性的细胞，用3三1.4ml.新鲜培养液悬浮细胞，取1/2（1.5m1.2-U细胞悬液与大约同等数琏的新鲜制备的正常细胞联合培养,重亚步骤（O.检测至第3代.取剜余2（1.5m1.-2ml.）细胞悬液禹心后保存于70C待查“e） 病毒抗原和核酸检刈：刮取少成细胞制备抗原片,利用汉用病毒特异性抗体进行免授荧光检测，如果灵光检测阳性，说明存在病毒红利，应参照汉坦病毒核酸检测方法，提取核酸，进行序列分析，并妥善保存。连续传代至第3代，检测仍为阴性者，可判断为阴性，相应培养物可按废弃物处理。f）废弃物处理；所有实验用品都应严格按照有为实骁空安全管理条例处理方法

12、高压处理,83.4结果判断结果判断规则如F：a）免授英光法检测用于分离汉坦烧毒细胞，着受光呈阳性，提示在细胞中有汉坦病毒史制，若阴性，提示细胞中未发生病毒显著或制。b）用于分离汉坦病毒的传代细胞中，病得基因组核酸检测阳性，提示在细胞中有汉坦病毒复制,若阴性提示细胞中未发生病毒显著复制.B3.5意义阳性结果，表明患者汉H!病毒感染；阴性结果,不能排除诊断“附录C(资料性)流行性出血热病原学临床及流行病学资料C.1质原学可引起流行性出血热的汉坦病毒分类属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)汉坦病毒科(Hantaviridae哺乳动物汉坦病毒亚科(MaimKintaVirinae)正汉坦病毒属

13、(Orthohantavirus),为有包膜的分节段单股倒链R*喻以，成熟的病用颗粒具有多形性，多呈网形或卵圈形,直径在75n三-210nm.平均直径约为120n三.基因组由JM和S三个片段组成.目前已分类的正汉坦病毒有38种，在我国漉行的汉坦病毒主要为首尔病毒(SeoulOrthohantavirus)和汉滞病毒(HanIaanOrIhohanIaVinJs)，宿主动物分别为福家M.和果线姬鼠,在棕甘辟等啮齿类宿主动物中还发现普马抗病毒PuuinalaOrthohantavirus)等其他种类汉坦病毒,但人间感染情况及致病特征尚不明确.汉坦病毒对一般有机溶剂和消毒剂敏感，飘仿、丙胡、B-丙内酯、酸(PH小于3)、茶的、甲醛等均可灭活，对温度、放射跷、紫外线等敏感，60C30min,粘VO及紫外级照射可灭活。C.2临床表现人搏染汉坦病舟后，潜伏期-殷为4d45d,多为7d14d.表现为急起发热，早期症状包括发热、头痛、寒战、肌癌、愁心、呕吐、腹痛、腹泻等,程度不同的面部和结膜等充m衣现，以及球结眼、腺F皮肤出血点等出