斑马鱼在药物毒理学评估中应用及机制的研究进展.docx

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1、摘要：与其他哺乳动物相比，斑马鱼具有繁殖能力强、繁殖量大、生命周期短、养殖费用低、身体透明等特点。主要从心血管毒性、肝脏毒性、肾脏毒性、神经毒性、脾脏毒性和急性毒性6个方面进行归纳总结，结果发现斑马鱼的多个器官在形态、基因表达及生理特性方面均与哺乳动物高度相似，已被广泛应用于药物的毒性物质筛选研究。药物对斑马鱼毒性研究主要集中在死亡率和畸形率增加，心、肝、肾、脾等脏器形态、表型改变并伴有水肿及神经毒性等方面；其毒性机制主要涉及影响器官中细胞凋亡（p53通路）、炎症（NF-KB通路、白介素）或影响该器官功能蛋白、酶或mRNA,如丙氨酸氨基转移酶（A1.T）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乙酰胆碱

2、酯酶（AChE）,微球蛋白前体（mbp）和微管蛋白（tubulin）等。斑马鱼模型可作为一种评估药物安全性与毒性最为高效、快速、便捷的方法，阐明药物的毒性作用及其多组分多靶点的毒性作用机制，可为药物毒理学中的毒性评估提供新的思路。斑马鱼俗称为斑马担尼鱼、蓝条鱼、印度鱼，是一种原产于印度和孟加拉国的辐鳍亚纲鲤科热带硬骨鱼，身上有数条可直达尾鳍的深蓝色条纹，因其全身条纹形似斑马纹而得名。斑马鱼是仅次于小鼠的第2大模型生物，其具有体积小，样本量大，胚胎透明易于观察，与人类基因同源性高和实验周期短等优势1-3,其胚胎、幼鱼和成鱼最早是被用来检测水中的有毒物质和致畸物4。后来也用于环境污染物的毒性评价，

3、如原油、农药、重金属、工厂污水和消毒副产物等对生态环境的毒性损害5-7。StreiSinger等于1981年首次将斑马鱼与遗传学和生物学领域划上联系，使其研究领域得以拓展和延伸。目前，斑马鱼已被广泛用于遗传学、生态毒理学、药物药效活性物质筛选、药物代谢、药物毒性物质筛选等方面9-11。斑马鱼在药物毒理学评估中的应用汇总如图1所示。XE马鱼箱bs*3I3IIfc二SMMS；i版II亡I充;.2IT1毒性作用及机制研究工因分机(qPCR)-H分析(Ueaemblomng)代分析(MFA)画何毒性作用及多坦分多Ie点作用机制图1黄马鱼在药物蠹理学评估中的应用F.1ApplkarionofZebraf

4、iSIIindingtoxicologyassessment提高药物早期毒性预测的可靠性和灵敏度已成为新药开发行业的迫切需求，而斑马鱼具有高通量的评价、检测和筛选药物毒性作用的独特优势，其作为药物毒性与安全性评价的实验动物受到医药学界越来越多的重视，已逐渐成为药物研发过程中毒性评价和安全性评价的重要工具12。结合国内外文献报道，本文综述了斑马鱼作为新兴模式生物在药物毒理学评价方面的研究进展，主要从药物心血管毒性、肝脏毒性、肾脏毒性、神经毒性、脾脏毒性和急性毒性6个方面及多组分多靶点的毒性作用机制进行归纳总结，以期为斑马鱼在药物毒理学中的毒性评估提供新的思路。1评估药物的心血管毒性1.1 斑马鱼

5、评价心血管毒性的优势心血管毒性是药物研发的主要限制因素口引。斑马鱼的心血管系统是由心房、心室、静脉窦和动脉球串联而成14,其心脏发育是一个迅速但复杂的过程,胚胎在受精后5h(hourspostfertilization,hpf)时心脏前体细胞成型,22hpf时心脏开始出现收缩动作，48hpf时功能性瓣膜逐渐形成，心率趋于稳定，72hpf时完成胚胎期心脏的发育。与此同时.，斑马鱼在24hpf时尾部由蜷缩状态开始伸展，节间血管开始生长，到48hpf时节间血管基本发育完全。有研究报道，斑马鱼心脏发育的形态、基因、生理特性以及血管生成过程均与哺乳动物相似15-16,可通过光学显微镜对其心脏、血管和血液

6、流动状态进行全程的监视，用于探究药物对斑马鱼的心血管毒性作用，为筛选药物的心血管毒性作用提供有效依据17。目前，在血管系统、血液、内皮细胞和心脏中表达荧光蛋白的转基因系斑马鱼的可用性也有助于精确和准确地评价药物对心血管系统的影响18。可见斑马鱼的上述优势使其成为筛选药物心血管毒性的重要生物模型。1.2 药物对心血管毒性的影响传统中药中提取分离出的很多单体化合物具有明显的药理活性，可以作为新药研发过程中的先导化合物，但是由于它们可能具有一些潜在的心血管毒性作用而限制了其临床应用。何俊霖等19以2、4、8、10gm1.异甘草素处理正常斑马鱼胚胎10、24h,结果显示异甘草素质量浓度高于2gm1.可

7、抑制斑马鱼胚胎血管生成，达8gm1.时，胚胎开始出现轻微血液瘀滞现象，且完全抑制尾部静脉血管的生成。异甘草素处理12h后，胚胎心率随异甘草素质量浓度的升高而呈降低的趋势，当质量浓度达到10gm1.时，对胚胎心率有持续性的抑制作用和诱发心脏畸形的作用，导致胚胎心包和卵黄囊肿大。这表明高剂量的异廿草素对斑马鱼的胚胎发育有较强的毒性作用。赵慧等20建立阿霉素诱导的转基因Tg(cmlc2:EGFP)系心脏特异表达绿色荧光斑马鱼心肌损伤模型，结果显示阿霉素30、40gm1.干预24、48h后，胚胎生存率显著降低，其活动受到抑制，心房、心室变大，出现不同程度的心包水肿，且动脉球间距显著增大；病理染色结果也

8、提示给药后斑马鱼心脏明显变大，且结构紊乱，有红细胞溢出等。此外，氯化铁、广蕾香、诺氟沙星、京大戟等对斑马鱼心血管发育生长也具有一定影响121-27o斑马鱼在药物心血管毒性中的研究见表1。表1斑马鱼在药物心血管毒性研究中的应用TaMe1AppbcarionofZebnIfhhinSnIdyofdrugcardk)vascuhrtoxkin利马鱼基因型bf给药时间b检测指标实验结论理斤甘草素Tg(JDrl：GFP)1012-48畸形率：存活率：胚胎血管生6、8咫血】异甘草素具有良好的抗I1.成：厩胎心率：心脏形态管生成和减慢心书的作用.I0gm1.T具有一定的考性19Tg(Ek2：EGFP)362

9、4-48生存率：动肽球间距：HE染同露素时理马鱼胚脂的心肌畏伤作用色：DAPffirlUNE1.染色呈时间和浓度相关性,其机制可健与增加心肌细总碑亡有关20京大粮AB品系1260心脏形态：胚胎心率：动味球京大财趣马鱼胚胎具行心脏有性,但悯距：心脏细也再亡M制后能减镀对心肌组Ift的描伤.从而降曼其心股毒性21氯化假Tg(Cwk：GFP)666死亡率I胚胎心率：心脏形态I2、4molU氯化馔对理马鱼心脏有件动脓球向距找为明S22多肽Ml1.ARS1.KTMTtma品系0.7536-72胚胎心率：心包发角情况：G多肽3M1.ARS1.KT刈可能影响逆马鱼胚脏形态:Mvrnhc、MR胎阚心脏的发育及

10、雁和血25基因的表达23诺氟沙星AB品系66-90死亡率：脊柱弯蓟；心包囊肿：诺氟沙星对药马鱼胚胎的发。具有数卵黄囊肿：TGF-l基因的崎和致死作用故24广香油及其主要成分AB品系1024-961.D：死亡率：存活承；瞄影广油及其主要成分对理马他胚胎*：斑胎形态：脊柱弯曲；发育均有心胺毒件寺性大小：广报尾次数：胚胎心率在丽广，香静广青春泊25紫草素Tg(.AW：GFPKAB品系0、10、24、4812T1.D：畸形率：死亡率：胚胎紫甲素对司马鱼胚胎发自具有*性.并心率：胚胎如管生或对其血管生成有一定的抑制作用26木番挥发泊AB品系2、12、24361.D：崎形率：胚龄心率；心木香挥发油对国马鱼

11、胚饴发育有一定脏腕的毒性,而且发育期越早，对其心脏毒性超大273l书化生K因子干1S半数致死，TGFflt1111fc11mnggrowthaClorfl1.D50*medumlethaldose1.3 药物对斑马鱼心血管毒性的作用机制赵慧等20通过阿霉素建立心肌损伤模型，通过DAPI和TUNE1.染色发现阿霉素40gm1.组斑马鱼心脏明显变大，细胞数目减少且较稀疏，细胞核增大,凋亡细胞增多，且阿霉素对斑马鱼胚胎的心肌损伤作用呈时间和浓度相关性。表明阿霉素诱导的斑马鱼心肌损伤模型是可靠的，且其机制可能与增加心肌细胞凋亡有关。王冬梅等24观察了0、10、20、40mol1.诺氟沙星对斑马鱼胚胎不

12、同发育时期脊柱弯曲、心包囊肿、卵黄囊肿和死亡率等毒性作用，结果显示随着诺氟沙星暴露浓度的增大，胚胎的发育延迟，孵化时间延长，胚胎死亡率增加；且暴露于不同浓度诺氟沙星的斑马鱼胚胎中TGF-l基因表达随发育时间延长而增加趋势减缓。提示诺氟沙星的心脏毒性机制与TGF-Pl基因相关。2评估药物的肝脏毒性2.1 斑马鱼评估肝脏毒性的优势药物性肝损伤已逐渐变成临床医学和新药研发中的一个重大挑战。因此，寻找新的模型来预测潜在治疗药物是否导致药物性肝损伤迫在眉睫。研究表明，斑马鱼肝脏在28hpf时开始发芽，在72hpf时被血液灌流并具有生理功能，在肝脏的形成过程中，其通体透明，易于观察28-30。有研究显示，

13、斑马鱼的器官、生长因子和基因的表达、肝细胞组成、功能、信号和对损伤的反应等方面与高等脊椎动物有很多相似之处31-32,使其成为检测药物肝毒性和研究其肝毒性机制的重要手段。将胚胎或幼鱼暴露，通过观察肝脏表型、特殊染色处理或生化指标检测等手段，可直接或间接探究药物对斑马鱼肝脏的影响。此外，采用肝脏荧光转基因斑马鱼，如Tg(fabpl:EGFP)、Tg(zlyz:EGFP)等作为模型，是评价肝脏毒性的又一手段，通过斑马鱼整体图像的分析技术，对肝脏面积大小和肝脏荧光强度进行综合定量分析，快速、系统的评价药物的肝脏毒性作用33。因此,斑马鱼作为药物肝脏毒性筛选的模式生物，也具有重要的意义。2.2 药物对

14、肝脏毒性的影响段亚辉等34采用斑马鱼模型比较款冬花、叶的肝脏毒性，观察款冬花和叶给药后3d对健康AB系及转基因系斑马鱼肝、肾形态、肝脏的荧光面积、肝脏丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,A1.T)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST),结果显示款冬花和叶对斑马鱼肝脏生化指标无显著影响，但款冬花1.5mgm1.组斑马鱼肝脏荧光面积减小，提示款冬花对肝脏产生一定的毒性，款冬叶未表现出明显的肝毒性。全云云等35首次用肝脏荧光转基因斑马鱼Tg(Ifabp：EGFP)对何首乌中的18种成分进行了肝脏毒性研究，检测斑马鱼肝脏表型、面

15、积、荧光强度、肝体比和病理情况等指标，结果发现，何首乌肝毒性的物质基础可能是由葱醍类化合物介导，且以结合葱醍为主，同时发现芦荟大黄素和芦荟大黄素-8-0-葡萄糖昔对斑马鱼体内A1.T、AST、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和总胆红素(totalbilirubin,TBI1.)水平、肝脏组织病理等影响较大，可能是肝毒性主要物质基础36。此外，毗嗪酰胺、香加皮、芫花等对斑马鱼肝脏毒性作用，也取得了一定的成果3740。见表2。表2858鱼在药物肝脏毒性研究中的应用Table2ApplicationofZebrafiShinstudyofdruglivertoxicity药物亚马鱼基t!tpf给药时fm检测指标实验结论文献款冬叶、花Tg(物步：EGFP)、7272死亡料肝脏形态：叶JK荧光IS积：故冬花在离荆量时对肝脏产生一定的毒性，34AB品系A1.T：AST；定马鱼表53培养液而款冬叶未表现出明显的肝脏有性蛋白何苒马Tg(labp：EGFP)7272肝脏表型：舒跳HE染色：肝脏炎光何首日的肝毒性作用可能是由蕙敏炎化合物