最新：气相色谱-质谱联用技术尿液多种有机酸检测专家共识.docx

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1、最新：气相色谱质谱联用技术尿液多种有机酸检测专家共识摘要随着气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)检测尿液有机酸越来越广泛地用于辅助遗传代谢病诊断和高危筛查，开展GC-MS检测尿有机酸的实验室越来越多。国家卫生健康委临床检验中心于2017年启动了临床实验室GC-MS检测室间质评活动，但各实验室检测技术水平参差不齐，实验室检测技术和临床应用缺乏统一标准。因此，国家卫生健康委临床检验中心新生儿疾病筛查室间质评专家委员会组织专家，就GC-MS检测尿液中有机酸的实验室检测技术、相关试剂及内标设置、基于专用软件的检测指标及其参数体系、标准操作流程及质控管理等进行讨论，形成共识，报道如下。1 GOMS技术应

2、用概况气相色谱技术(gaschromatography,GC)是一种经典的分析技术方法，该技术根据待测物质在被载气携带进入填充柱或毛细色谱柱中气相和固定相间分配系数的不同，各组分经过反复多次分配从而实现分离和依次出峰(定性)。质谱技术(massspectrometry,MS)是一种通过检测目标样品带电离子的质荷比(mz)来进行分析的方法。MS技术检测具有强特异性和高灵敏度的优势，质谱分析可提供丰富的结构及特征离子峰信息，可根据目标化合物质谱的特征离子峰来确定分子结构，也可通过谱库检索来定性。将GC与MS联合，则可对待测物质进行精准定性定量，称为气相色谱-质谱联用技术。GC-MS技术可用于分析尿

3、液样本中数百种有机酸，自1966年Tanaka运用气相色谱-质谱联用技术报告首例异戊酸血症以来，已有250多种具有临床意义的有机酸指标被检出。尿液中有机酸的升高或异常出现与体内碳水化合物、脂肪酸、氨基酸、维生素、糖、电解质类的代谢紊乱或遗传代谢障碍导致底物贮积和旁路代谢物大量产生有关。基于尿液有机酸检测,很多遗传代谢病逐渐被发现。目前GC-MS较多用于有机酸尿症为主的遗传代谢病检测，逐步在多种遗传代谢病筛查诊断和出生缺陷防控中发挥作用1-4。GC-MS检测技术具有高特异性、高灵敏度、高准确性、高通量、快速、自动化等优点，已成为遗传代谢性疾病辅助诊断和高危筛查的重要手段之一，国外于20世纪70年

4、代就开始应用于有机酸尿症的筛查诊断，我国近20年来逐步引进GC-MS技术，尤其是近三年来步伐明显加快，全国各地开展GC-MS遗传代谢病检测的实验室越来越多，大家对遗传代谢病的关注也越来越多，帮助很多遗传代谢病患者获得了正确的诊断与治疗5-7。2 GOMS实验室检测技术GC-MS是对尿样多种有机酸进行检测的一种新技术。在尿液或尿滤纸片复溶液样本中加入稳定内标，经过一段时间的胎化反应后进行有机溶剂液萃取，转移提取物氮气吹干，衍生化后用GC-MS仪进行分析使用GSMS数据库检测系统进行数据分析。2.1检测原理GC-MS由气相色谱仪和单级四极杆质谱仪两个部分组成，利用气相色谱仪的分离能力对尿中多种有机

5、酸代谢物有效分离后，再通过质谱部分鉴定分离的组分（定性），基于内标技术半定量计算出相应含量。由于尿液中代谢终产物浓度高于血液，且尿液样本可通过体外无创的方式进行收集，大部分尿液中的代谢产物具有容易挥发的特性，故而通过该分析技术检测尿液样本中的特异性代谢产物，可为遗传代谢病的筛查与诊断提供可靠依据。气相色谱分析通常使用高纯氨气(He)为载气，在色谱柱中的固定相为吸附剂，利用吸附剂对待测样品中各组分的吸附力不同的特性以及亲和力、溶解度、阴滞等物理性质的不同，物质随载气移动经过一定时间后，不同组分在相对运动的两相中具有不同的分配系数即在色谱柱中的运行速度差异，基于以上原理待测样本不同组分得以在色谱柱

6、中实现分离。根据分离后各组分在色谱柱中保留时间不同进行待测样本的定性，其检测结果为不同色谱峰，不同时间段的色谱峰代表不同成分，色谱峰的丰度和响应值表示该成分含量的多少。当通过色谱柱分离的各组分进入质谱后，分离后的这些中性化合物分子组分在质谱离子源中发生电离，产生不同质荷比的带电离子在四级杆电场的作用下形成离子束，由于每种化合物分子具有特殊的化学结构，故不同的化合物分子被电离后产生具有特征性的碎片离子，最后经质谱的质量检测器得到每个组分的碎片离子质量数分布图称为质谱图，检测得到的质谱图通过与美国国家标准与技术研究院(nationalinstituteofstandardsandtechnolog

7、y,NlST)谱库的标准质谱图对比确定该组分是什么物质，即定性分析。再通过计算每个分析物和检测中同时加入的已知浓度内标物之间信号强度比率作半定量分析，最后将所有目标分析物与其特异性对应的疾病信息进行关联，基于正常人群化合物建立的参考区间，综合分析进一步推测罹患某种遗传性代谢病的可能8。质谱仪器建议由专人进行管理，周期性进行性能核查、使用记录登记和维护保养，并按照实验室要求制定相应的仪器操作、维护标准作业流程模板。仪器需贴有相关设备标识，内容应包括：仪器型号、用途、使用状态及检查周期等信息。2.2实验检测操作流程依据新生儿疾病筛查管理办法（卫生部令第64号）及新生儿疾病筛查技术规范（2010版）

8、的规范要求9-10,实验室检测工作流程符合规范，并制定从样本接收、报告解读以及随访复查全流程环节的操作标准，见图”11-13。图1Ge-MS实验检测操作流程3试剂3.1试剂要求(1)实验所需化学试剂均要求色谱级或以上；(2)配制各种试剂和标准溶液必须遵守操作规程，试剂配制完成后及时贴标注明试剂名称、浓度、配制日期、批号、有效期和配置人；(3)试剂存管规范化：专人负责，分类存放，并定期检查使用及余量情况。领用时需填写记录，过期或失效试剂经审核后作报废处理；(4)建立危化品及易制毒试剂管理程序，分类专柜存放，由两人以上人员保管，要填写相关实验记录，保护人员安全14。试剂组成：由尿素分解试剂、胎化反

9、应试剂、液液萃取试剂、衍生化试剂组成。(1)尿素分解试剂：尿素酶和超纯水按照一定比例混合组成；(2)胎化反应试剂：盐酸羟胺、氢氧化钠及盐酸；(3)液液萃取试剂：主要采用色谱纯乙酸乙酯；(4)衍生化试剂：N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(含三甲基氯硅烷)(N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamidewithTrimethyIChIorOSilane,BSTFA:TMCS=99:1),如使用商品化检测试剂盒，则按说明书进行相应操作。3.2内标内标包含十七烷酸，托品酸，二十四烷，稀释液采用色谱纯乙酸乙酯，使用稀释液将十七烷酸、托品酸和二十四烷配制为浓度分别为0.

10、5mgmL0.5mgmL和ImgmL的混标溶液。选择这三种内标理由如下，首先常规尿液中含量极低，和代谢障碍没有关联，样本前处理中硅烷化衍生后结构稳定，不与目标有机酸发生反应，且仪器分析中出峰时间分布整个分析过程的前、中、后段。以十七烷酸作为定量内标，目标物有机酸的峰面积和十七烷酸峰面积进行比值，得到半定量的结果；托品酸及二十四烷作为内标质控，可准确监测样本前处理和仪器分析是否符合质控要求。3.3样本尿液样本：（1）干燥洁净容器采集新鲜随机中段尿液；（2）分装至容量为IomL的带盖EP管中;（3）样本量要求6mL（2mL检测;2mL复检;2mL留样）；（4）冰冻保存，冷链运输至检测机构。尿滤纸片

11、15:（1）专用滤纸片三片（新华3号滤纸,规格4cm4cm）完全浸透于尿液中；（2）样本量要求6mL（2mL检测；2mL复检；2mL留样）；（3）浸泡时间15min,于干燥阴凉避光处晾干,密封储存；（4）长期留样则冷藏密闭保存（温度白20。C）,建议优先使用原始尿液进行检测，尿滤纸片便于样本长期保存和运输，但尿滤纸片样本分析过程中，由于增加了滤纸片制作及超纯水复溶等流程，会造成不可预知的误差16。3.4进样前处理3.4.1样本准备样本前处理基于溶液进行，如采用尿滤纸片，则需要进行超纯水复溶，流程如下：（1）取一片尿滤纸片，剪至ICmXlCm合计16个碎片，放置于10mL离心管中，加入2.5mL

12、超纯水,浸泡10min;（2）离心4000rpm,5分钟后,取上清液（注意须无纸片残渣）。3.4.2尿肌醉测定17尿肌肝为尿液中最稳定的代谢产物，本实验需采用0.2mg当量尿肌酊的尿液进行分析，参考尿中肌酎分光光度测定方法（WS/T97-1996）标准，采用紫外可见分光光度计对尿液或尿滤纸片复溶液中的尿肌酊进行定量检测。3.4.3前处理取0.2mg肌好当量的尿样后，进行前处理，流程包括除尿素、添加内标、胎化、液液萃取、氮吹、衍生、转移上机等。（1）加入尿素酶试剂，37。C恒温孵育30分钟，分解尿素，消除干扰；（2）加入内标，纯水定容至2mL;（3）加入胎化反应试剂，室温下胎化反应20分钟；（4

13、）色谱纯乙酸乙酯萃取2次，充分混匀后离心，转移至上层有机相至干洁离心管；（5）60。C氮气吹干，注意应避免吹干过度造成降解；（6）加入衍生化试剂，70。C孵育30min;（7）待样本温度降至室温后,转移至进样瓶内插管，上机分析18-20。3.5仪器与软件选择3.5.1仪器选择首选用于新生儿遗传代谢病尿液有机酸的检测仪器是气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）。首先，该仪器配备的电子电离源（electronionization,EI）是最常用的离子化模式,电离效率高，谱图特征性和重复性好，通过碎片模式可得到大量的结构信息，被90%的气相色谱-质谱联用仪所采用。其次，四级杆质量分析器适用于中小有机酸化

14、合物的定性和定量分析，实验人员可灵活配置和调用全扫描（full-scan）模式和选择离子扫描（SeIeCtedionmonitoring,SlM）模式,更好地服务于临床实验。最后,选择气相色谱-质谱联用仪时，需考虑：（1）精密度、检出限、离子化效率、离子源峰型、数据采集时间、分辨率、检测效率、背景噪声、灵敏度等；（2）仪器检测通量，即每天可检测的标本量；（3）其他因素：实验室使用习惯、仪器成本等。3.5.2软件选择气相色谱-质谱联用仪需配备软件系统，用于对检测样本进行数据分析。GC-MS尿液有机酸检测专用软件应最大程度简化数据分析流程，具备以下特征：（1）可操控检测仪器（即自动进样器、气相色谱

15、和质谱）；（2）分析样本中各种有机酸目标物与内标的峰面积，同时计算出多种分析物的半定量结果；（3）将分析物浓度与设定的正常参考区间进行自动比较，显示标注超出正常参考区间的结果；（4）检测结果与患者信息自动匹配导出结果数据；（5）可快速批处理分析样本检测结果及单个样本快速分析；（6）允许设置定量积分参数进行检测结果校正21。3.5.3数据采集模式选择(1)全扫描采集模式(fullscan):在一定扫描质量范围(mz)内，对所有质量离子按照从小到大的顺序连续扫描，可以得到最大的信息量，并利用谱图进行检索。质谱仪采集尿液中所有有机酸衍生物质量数范围建议为50500mz,扫描450个质量离子，一次扫描

16、循环时间为005s,每个质量离子采集时间约0.11mso采集时间需涵盖所有目标物有机酸出峰时间，且需避过溶剂峰出峰后开始采集，这样可以保护灯丝及检测器,例如7.560min0(2)选择离子扫描模式日electedionmonitoringfSIM):在选择离子扫描模式下，对选定的某个或数个特征质量峰进行单离子或多离子检测，获得这些离子流强度随时间的变化曲线的扫描。在一般情况下可用于已知检测物质的特征离子，质谱图不能用于谱库检索。选择离子扫描方式只选择23个特征离子，一次扫描循环时间同样为0.05s,则每个质量离子的采集时间为16.7ms,时间增加150倍，相较于全扫描模式单个离子检测时间长、离子响应高、灵敏度好，但检测的离子数有限。实现一次进样完成尿液多种有机酸同时检测，质谱仪必须具备快速扫描、连续循环扫描和跳跃循环扫描的能力，以适应GC-MS的全扫描采集(fullSCan)和选择离子扫描模式(SlM),并确保