最新间接免疫荧光法用于抗核抗体实验室检测的中国专家共识要点.docx

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1、最新间接免疫荧光法用于抗核抗体实验室检测的中国专家共识要点摘要间接免疫荧光法是检测抗核抗体的参考方法，然而检测过程标准化程度低、检测结果报告一致性差是临床实验室面临的主要挑战。随着抗核抗体荧光模型国际共识组织对各荧光模型进行标准化命名，以人喉癌上皮细胞为基质的间接免疫荧光法实验由手工操作逐步转向全自动仪器操作以及计算机辅助诊断系统的临床应用，实验室对该项目的规范化检测及结果报告提出了新的要求。本共识从检验项目开展前、检验过程和结果报告3个方面进行阐述并提出相应意见，旨在进一步推进该项目在我国实验室检测与报告的规范化与标准化。抗核抗体(antinucIearantibody,ANA),广义上是指

2、针对真核细胞各种抗原成分的自身抗体，是系统性红斑狼疮(systemicIupuserythematosus,SLE)、干燥综合征(Sjgren,Ssyndrome,SS)、系统性硬化症(systemicscIerosis,SSc)混合性结缔组织病(mixedconnectivetissuedisease,MCTD)和特发性炎症性肌病(idiopathicinfIammatorymyopathy,IIM)等自身免疫病的重要血清学标志物。这些疾病由于与ANA的密切关系，也被称为抗核抗体相关风湿病(ANA-associatedrheumaticdiseases,AARD)oANA的检测对于AARD的

3、诊断和疾病分类具有重要意义。2019年欧洲抗风湿病联盟/美国风湿病学会(EuropeanLeagueAgainstRheumatism/AmericanColIegeofRheumatoIogy,EULAR/ACR)SLE分类标准的准入条件是：以人喉癌上皮细胞(humanepitheIioma-2,HEp-2)为基质的间接免疫荧光法(immunofluorescenceassay,IFA)检测ANA阳性(滴度Nl：80),或与HEp-2IFA具有等效敏感性的固相ANA筛查试验阳性1HEp-2细胞是包含100多种自身抗体靶抗原的“天然阵列”，以其作为基质对ANA进行IFA检测，敏感性高，是目前公

4、认的ANA检测的参考方法2o作为自身抗体检测实验室广泛开展的检测项目，HEp-2IFA检测ANA仍存在手工操作占比重高、检测标准化程度低、实验室间检测结果差异大和需要实验室配备专业读片人员等问题。近年来，在促进HEP-2IFA检测ANA的规范化和标准化上，国际和国内专家学者以及相关企业作出巨大的努力。ANA荧光模型国际共识组织(theInternationaIConsensusonANAPatterns,ICAP)提出了以AC(anti-celI)编号的ANA荧光模型的命名3、临床相关性4以及结果规范化报告指南5,欧洲检验医学联合会、欧洲自身免疫标准化促进会和ICAP共同发表了对ANA检测的推

5、荐意见6;我国参加ANA室间质量评价的实验室数量与合格率不断提升7,8;全自动荧光制片机以及计算机辅助诊断(computer-assisteddiagnosis,CAD)系统在临床工作中的普及率逐步增高9,10然而，目前我国仍缺乏HEp-2IFA实验室规范化检测ANA的指南。在临床实验室逐步由HEp-2IFA检测ANA的手工操作发展为自动化仪器检测结合CAD系统辅助荧光读片的现状下，中国中西医结合学会检验医学专业委员会和上海市医学会检验医学专科分会（以下简称“专委会”）共同制定了间接免疫荧光法用于抗核抗体实验室检测的中国专家共识（2023年）（以下简称共识），旨在进一步提高HEP-2IFA检测

6、ANA的质量和结果的一致性，为各级医院从事自身抗体检测相关工作的医务工作者和科研人员提供切实有效的建议。共识制定过程、证据概述和专家评分一、制定过程共识制定过程分4步进行：首先专委会专家讨论确立了本共识主要内容，即从检验项目开展前（性能验证、临床沟通、人员培训、仪器校准和标准化操作程序制定）、检验过程（实验室检测、质量评价、批号验证）和结果报告（荧光模型报告、滴度特异性似然比、报告模板）3个方面进行论述；结合中国合格评定国家认可委员会（ChinaNationaIAccreditationServiceforConformityAssessment,CNAS）对医学实验室IS015189评审要求

7、和文献学习以及多家医疗机构的临床工作实践形成草案，后经专委会讨论并修改形成推荐意见分级的评估、制定及评价（gradingofrecommendationsassessment,deveIopmentandevaIuation,GRADE）方法的证据质量分级11;草案提交专家组评分后统计每条建议的专家认可度；最终对所有问题进行公开讨论并修改完善后定稿。二、证据级别评价标准共识中参考文献证据按照GRADE系统共分3级11,表述如下。证据质量高（八）：证据基于多项随机临床试验或荟萃分析，进一步的研究不太可能改变对效果估计的信心。证据质量中(B)：证据基于单项随机临床试验或多项非随机对照研究，进一步的

8、研究可能会对效果估计的信心产生重要影响并可能改变评估结果。证据质量低或非常低(C):仅为专家意见，或基于注册研究结果，进一步的研究很有可能影响对效果估计的可信度，且很可能改变评估结果。三、专家评分专家对于共识意见(表1)的认可度以DelPhi评分进行打分(分值OiO分)，0分表示完全不赘同，10分表示完全赘同(02分反对，34分不推荐，56分酌情推荐，78分推荐，910分强烈推荐)。专家认可度以所有专家打分的平均数土标准差(图片)及其95%可信区间(COnfidenCeintervaI,Cl)表示。检验项目开展前一、性能验证HEp-2IFA是ANA检测的筛查试验，属于临床免疫学定性检测项目，其

9、结果通常包含荧光模型和半定量滴度。影响HEp-2IFA检测ANA结果的因素较多，如：商品化试剂盒中基质HEP-2细胞，在培养、固定和透化过程中导致的细胞抗原反应性不同12,13；荧光二抗的浓度、与人免疫球蛋白G（immunoglobulinG,IgG）结合的特异性、荧光素/蛋白摩尔比不同14；洗液、封片介质不同；实验操作及环境温度影响；显微镜光源不同（发光二极管灯、汞灯或金属卤化物灯）或是否采用CAD系统等。因此，临床实验室在项目开展前，需要对产品进行性能验证，验证内容至少包括：符合率、精密度和参考区间15,16o使用CAD系统以及全自动荧光制片机的实验室也需要在项目开展前完成相关比对和验证工

10、作。（一）符合率HEp-2IFA检测ANA的符合率通常选择同品牌试剂进行比对，优先选择已开展该项目且通过CNAS认可的医学实验室。比对样本要求15,17：（1）至少30份血清样本，其中阴性、弱阳性以及阳性样本各10份；（2）阴性样本应包含显微镜下有荧光，且强度不强于阴性质控和荧光模型不清的样本；（3）阳性（含弱阳性）样本建议尽量覆盖临床常见或有重要临床意义的荧光模型6,且涵盖细胞核荧光模型以及细胞浆荧光模型，包括但不限于：均质型（AC-1）、致密细颗粒型（AC-2）、着丝点型（AC-3）、核颗粒型(AC-4,5)、核点型(AC-6,7)、核仁型(AC-8,9,10)、核膜型(AC-11,12)

11、、胞浆线性/肌动蛋白型(AC-15)、胞浆颗粒型(AC79,20)、胞浆网状/线粒体样型(AC-21)；(4)阳性样本建议尽量包含临床常见特异性抗体阳性样本,如：抗双链DNA(doubIestranddeoxyribonucleicacid,dsDNA)抗体、抗干燥综合征抗原A(Sjgren,SsyndromereIatedantigenARo60,SS-ARo60)抗体、抗斯密斯(Smith,Sm)抗体、抗Ul小核核糖核蛋白(UlsmaIInuclearribonucIeoprotein,U1-snRNP)抗体、抗着丝粒蛋白-B(centromereproteins-B,CENP-B)抗体、

12、抗可溶性酸性磷酸化核蛋白100(speckledprotein100,Sp100)抗体、抗跨膜糖蛋白210(gIycoprotein-210,gp210)抗体、抗核糖体P蛋白(ribosomaIP,Rib-P)抗体、抗组氨酰tRNA合成酶(histidyltRNAsynthetase,Jo-1)抗体和抗线粒体抗体-M2型(anti-mitochondriaIantibody-M2,AMA-M2)o若在某一时段内，所收集样本暂时无法满足上述要求，可用室间质评样本或血清基质质控品替代，但仍需在半年内完成临床样本收集和符合率验证6,15Jo将比对样本随机分成5组，每天检测1组，每组6个样本，连续5d

13、,按照患者样本检测程序进行检测，阴阳性一致，阳性样本荧光模型相同且在上下一个滴度范围内为符合，计算KaPPa值和符合率15,18,Kappa值20.8且符合率280%为可接受标准。(二)精密度HEp-2IFA检测ANA结果中滴度是以量值形式表达的定性结果，需进行精密度验证，包括重复性和中间精密度。应评估阴性、弱阳性和阳性3个水平，阳性（含弱阳性）样本可选用临床常见荧光模型，如：均质型或核颗粒型。重复性和中间精密度可同时验证，每天检测1个分析批，每个样本每天重复检测35次，连续检测5d19o当结果为二分类变量（阴/阳性）或有序分类变量（滴度）时，精密度验证所计算的是与原始结果的符合率，即阴阳性符

14、合，阳性样本荧光模型一致且上下一个滴度范围内的比率。精密度验证的可接受标准为所用厂商检验方法声明的标准，若无可用的厂商标准时，实验室可根据临床诊疗的质量要求确定可接受标准，建议可接受标准为与原始结果一致率280%（建议仪器制片法一致率290%）。（三）参考区间参考区间验证可通过检测至少20份健康人的血清样本，验证试剂盒厂家提供的参考区间，20例测定值中落在参考区间外的测定值不超过2个，参考区间可直接使用20Jo实验室也可设置适合本地区的参考区间，建议使用非参数的百分位数方法建立临界值,推荐采用95的百分位数21,大于临界值判断为阳性。（四）CAD系统验证采用CAD系统进行HEp-2IFA检测A

15、NA结果报告须对该系统进行性能验证6o1 .阴阳性判读：需进行自动化判读系统与人工显微镜下判读阴阳性符合率的评估。实验室可自行设立判读符合率要求，但至少应280%9,22,23Jo2 .荧光模型判读：以读片人员判读结果进行报告，不推荐直接采用CAD荧光模型判读结果24Jo3 .滴度判读：CAD系统荧光强度与样本中自身抗体滴度具有相关性。ANA阳性样本CAD估算滴度与终点滴度一致性75.9%97.8%9,-10,25,但估算滴度通常高于终点滴度12个稀释度26Jo医学实验室若直接使用CAD系统的估算滴度进行报告，则需要在项目开展前对其与终点滴度进行符合率验证。若符合率未达到要求，实验室可依据荧光

16、强度和终点滴度的对应关系，建立合适的区间，并用独立样本进行符合率评估。在此过程中值得注意的是：(1)不同荧光模型中相同终点滴度样本的荧光强度分布差异较大，因此在实验室应至少建立并验证均质型、核颗粒型、着丝点型和核仁型4种常见荧光模型的估算滴度符合率9,26,27o(2)通过PASS15计算样本量，构建受试者工作特征曲线下面积(areaundercurve,AUG)的双侧95%可信区间，根据既往研究可知AUC约为0.969,用CIopperPearSOn精确概率法构建可信区间，当可信区间宽度为0.1时，每组所需阳性份数为30份。例如：倍比稀释系统下构建核颗粒型荧光强度与滴度对应值时,至少收集终点滴度为1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280和1：1280共6组样本，每组各30份作为