检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术.docx

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1、一、检测蛋白质与蛋白质相互作用(DFRET技术(invivo)FRET.Fluorescenceresonanceenergytransfer,即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下列图所示：以下列图为例，假设要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白,然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光,如果能检测到球色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，那么是这两种蛋白没有相互作用.醉母双

2、、三杂交技术(invivo)醉母双杂交系统主要用丁考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子,如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD.这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因(假设为A载体)，另一个含有BD基因(假设为B载体),一般将一个蛋白的基因连在B载体上，作为诱倒(Bait),将未知蛋白的基因连在A数体上，将这两个载体都转到特定的酹母细胞内，者未知蛋白与蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酢母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来：如果两者无相互作用，那

3、么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下列图所示：由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又开展出了别离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下列图所示：如下图，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(CUb)和N端段(NUbG).并在C端段的N湍接上一个LeXA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录(因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用).将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上,，假设两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合,形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白商体会将

4、这一段被泛素标记的片段降解,那么连接C端段的LeXA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达.醉母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第:个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互常近。第一：个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下列图所示：如上图所示，在参加第三种成分前,蛋白X与蛋白丫之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达：当参加第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD旅近，报告基因表达，从而可以被检测到. Pulldown技术(invitro)Pulldown,即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白所亲和层析的根底上的一种检

5、测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下列图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，到达纯化目的蛋白的作用。PUlldoWn技术利用的是亲和必析技术以及特异的配体(如GSH或者锲)。以下列图为例，将GST的基因与蛋白X的基因融合，表达出融合蛋白.将该融合蛋白的溶液过带有GSH配体的必析柱，那么这一融合蛋白就能结合在配体上，然后将待测蛋白的溶液过柱，并让其与融合蛋白反响一段时间。接着开始进行洗脱。如果待测蛋白与蛋白X无相互作用，那么在开始清洗的时候就会被洗下来：如果在用洗脱液洗脱

6、后才能在收集到的样品中发现待测蛋白(以及蛋白X),说明待测蛋白与蛋白X可能有相互作用. Farwesternblot(invitro)FarWeStemblOt是基于WeStembIot开展而来，其原理如下列图所示。将样品蛋白用非变性的PAGE皎别离，然后转股,封闭、洗膜，参加待测蛋白，使其与己在膜上的样品蛋白进行相互作用.接若参加带有标记(如HRP)的待测蛋白的抗体反响，最后进行显色(如参加HRP的底物)，观察实验结果。 免疫共沉淀(Co-IP)(invivo)免疫共沉淀是探测活体细胞内蛋白间的相互作用的一门技术。它的原理是当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质一蛋白质间的

7、相互作用被保存了下来。如果用蛋白X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内有相互作用的蛋白Y也能沉淀下来。CO-IP的原理如下列图所示，首先从细胞中提取蛋白质，获得蛋白提取液，并将其与抗体孵育，使抗体与蛋白X结合。将预处理过的ProteinG琼脂糖珠(Sepharose)参加到抗体与蛋白提取液的孵育液中反响，使抗体与PrOteinG结合。通过离心将琼脂糖珠沉降到管底，去除上清液，然后再用缓冲液将琼脂糖珠冲洗数次，最后用WeStemblot(或SDS-PAGE)进行检测。二、检测蛋白质与DNA相互作用 DNAfootprinting(invitro)DNAfootprinting的原理如下列图所示。将D

8、NA的一个3端用32P标记，然后将DNA分成两份，一份直接用DNaSeI进行不完全的切：另一份先与待测蛋白混合反响一段时间，然后再用DNaSe【进行不完全的切.然后将两份样品用交性的PAGE股进行电泳，观察电泳结果.下列图中，由待测蛋白与DNA结合的部位无法被DNaSeI醯切降解，因此它的电泳结果中与直接用DNaSeI进行处理的样品相比，会缺少一段：如果待测蛋白与DNA无相互作用，那么这两组的电泳结果应当一致。 EMSA(invitro)EMSA.EectrophoreticMobiIityShiftAssay,又称凝胶阻滞实验.其原理是与蛋白质结合的DNA在NatiVe-PAGE胶非变性胶)

9、上比没有结合蛋白的DNA移动速率要慢，因此通过电泳即可看到DNA的变化，如下列图所示.ScreenaPhagecDNA-librarybyDNAprobe(invitro)该方法又成为原位筛选法，用丁检测CDNA文库中的蛋白与DNA探针之间的相互作用.其原理和实险流程如下列图所示，首先是用噬菌体(Phage)侵染大肠杆菌，然后将这些大肠杆菌涂到平板上.接若进行转膜，将膜泡;IPTG水溶液中数小时，然后将该膜放了平板上，培养数小时IIPTG能诱导大肠杆菌表达文库蛋白).将膜取出，进行变性、笑性和封闭(过夜)，然后与放射性标记的DNA探针进行反响，最后洗脱、映干并用胶片曝光。如果胶片上出现/条带,说明该文库蛋白与DNA探针有相互作用：反之那么说明两者无相互作用。酵母单杂交系统(invivo)酹母单杂交系统的原理与双杂交一样，不同的是它主要用于考察CDNA文库中的蛋白与DNA(即特异的靶因子)是否有相互作用.其原理如下列图所示,首先需要构建一段序列(黑框)，它含有至少3个拷贝的特异的靶因子以及报告基因的序列.将该序列整合到醉母的基因组中，得到重组醉母“接若构建一个融合表达载体，它含有待考察蛋白的基因序列与转录激活结构域的序列。将该融合表达载体转入酵母中，观察报告基因是否能正常表达.如果报告基因正常表达，说明该CDNA文库蛋白与的靶因子间可能有相互作用：反之，那么说明两者无相互作用。